γ－聚谷氨酸/殼聚糖多孔復合支架材料的制備、表征及性能的研究

疏秀林，施慶珊 ，林小平，歐陽友生，陳儀本

廣東省微生物研究所廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室和廣東省華南應(yīng)用微生物重點實驗室 省部共建國家重點實驗室培育基地，廣州510070

殼聚糖是近年極具發(fā)展?jié)摿Φ纳镝t(yī)學材料，具有生物可降解性、生物相容性及抗菌性，且其在酸性環(huán)境下會形成帶正電的聚電解質(zhì)，可以很容易的和其他帶負電的聚電解質(zhì)或藥物(如生長因子等)形成聚合物，繼而增進材料的性質(zhì)，因此應(yīng)用極為廣泛，常被用在骨組織再造、藥物釋放、創(chuàng)傷敷料等應(yīng)用。但是，該材料目前尚存的缺陷在于:制成品的強度不夠，膜的力學性能差，脆性較大，吸收滲液能力不強、抗水性較差、降解時間過長。而且對于某些細胞而言，它的細胞相容性表現(xiàn)不是很好。常將殼聚糖與一種或幾種其它高分子材料復合以改善其性能［1］。

γ-聚谷氨酸［Poly(γ-glutamic acid，γ-PGA)］是一種典型的聚電解質(zhì)，由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過γ-谷氨酰鍵聚合而成的氨基聚合物(見圖1)［2，3］，相對分子量一般在10 萬～100 萬。與其他聚合高分子化合物相比，γ-PGA 在體內(nèi)能降解為谷氨酸單體，為人體所必需，生物相容性優(yōu)良，低免疫原性，無毒副作用，這是其它材料所不可比擬的。γ-PGA 鈉鹽在極性溶劑中溶解時，-COONa 基團電離形成聚合物離子-COO-和Na+，聚離子鏈上大量的凈電荷及鏈段間的靜電作用使γ-PGA 水溶液在粘度等諸方面表現(xiàn)出特殊的性質(zhì)。

圖1 γ-聚谷氨酸結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Chemical structures of poly (γ-glutamic acid)

在組織工程領(lǐng)域中很重要的一點就是人工三維材料與細胞的黏附性，γ-PGA 具有相當好的黏著性，其最大特點是:氨基酸基團能增加材料與細胞的親和性，能夠介導種子細胞與支架材料黏附，具有良好的生物適應(yīng)性，且因其廣泛的分子量范圍，可以通過改變其聚合度以及分子鍵交聯(lián)的程度來調(diào)節(jié)組織支架的降解速率。研究發(fā)現(xiàn)，在外科手術(shù)的臟器、止血劑及密封劑，γ-PGA 的機械輕度及止血功能遠超過傳統(tǒng)的纖維原止血凝膠。此外γ-聚谷氨酸經(jīng)由化學修飾可形成特殊的纖維，其用途可應(yīng)用手術(shù)后的縫合線或?qū)⒔退毓潭ㄓ诶w維上作為一特材質(zhì)。γ-PGA 價格遠低于目前進行研究生產(chǎn)和應(yīng)用的生物可降解材料聚天冬氨酸、聚乳酸等的原料L-乳酸、L-天冬氨酸。γ-PGA 作為組織工程支架材料在組織工程應(yīng)用方面有非常大的應(yīng)用潛力，但是目前國內(nèi)外這方面的研究報道非常少［4］。

本研究將殼聚糖與γ-聚谷氨酸這兩種生物材料，通過合適的結(jié)構(gòu)連接和劑型改造，力求解決支架材料中殼聚糖脆性大、降解速率較慢和殼聚糖機械強度較低的缺點，研究一種具有良好的生物相容性、一定機械強度、可控降解性能的理想生物醫(yī)學材料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

羧甲基殼聚糖(CMCS，阿拉丁公司);二甲基亞砜(DMSO，無水級別，阿拉丁公司);1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl，阿拉丁公司);4-二甲氨基吡啶(DMAP，阿拉丁公司);高糖DMEM(美國Gibco 公司)，胎牛血清(FBS，美國Hyclone 公司)，MTT 試劑盒(美國Am-resco 公司);1，6-hexanediamine(1，6-乙二胺，阿拉丁公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 γ-PGA-H+的制備

將市售γ-PGA-Na+加入單頸圓底瓶中，以4 倍(V/W)的蒸餾水攪拌溶解，然后加入0.8 倍(V/W)的37%鹽酸，配成濃度為2mol/L 的鹽酸水溶液，持續(xù)室溫攪拌直至有產(chǎn)物沉淀時再繼續(xù)攪拌6 h 反應(yīng)完全，最后利用真空抽濾方式收集沉淀產(chǎn)物，并用3～4 倍(V/V)的蒸餾水沖洗數(shù)次，冷凍干燥后保存?zhèn)溆谩?/p>

圖2 γ-PGA-H +反應(yīng)式Fig.2 The γ-PGA-H +preparation scheme

1.2.2 殼聚糖/ γ-PGA 復合材料的制備

稱取0.5 g γ-PGA 和0.05 g DMAP 超聲溶解于18 mL DMSO 中，將羧基殼聚糖溶液緩慢滴加到γ-PGA 溶液中，并伴隨磁力攪拌，滴加完畢添加一定量的EDC·HCl，室溫下攪拌3 h 后終止實驗。將混合溶液中添加三倍體積的丙酮，以形成沉淀，真空抽濾收集沉淀，將沉淀物進行冷凍干燥，去除多余的丙酮，再將沉淀物用PBS 溶劑(pH 值7.2)溶解，運用超濾透析法去掉多余的CS(透析袋截留分子量100，000)和多余的1，6-乙二胺(透析袋截留分子量3500)。梯度冷凍:以4 ℃、-20 ℃各2 h，-40 ℃4 h，-70 ℃24 h，之后進行真空冷凍干燥48 h，真空度達0.01 Pa。

1.3 結(jié)構(gòu)鑒定

1.3.1 氫原子核磁共振光譜(1H NMR)

聚合物產(chǎn)物溶解于D20 溶劑，送至廣州分析測試中心檢測。

1.3.2 傅里葉紅外線光譜儀( FT-IR)

稱取產(chǎn)物5 mg 加入200 mg 的KBr，利用壓力機壓成薄片后測量，單一樣品重復掃描16 次，測定吸收波長范圍為400～4000 cm-1，解析度為2 cm-1，吸收強度以穿透度(%T，transmittance)表示。

1.4 物性分析

1.4.1 支架材料孔隙率

將冷凍干燥后的支架材料粘附于樣品基臺上，二氧化碳(CO2)臨界點干燥，真空下噴金鍍膜，用掃描電子顯微鏡(Hitachi S-3000N，日本)觀察支架材料的形貌。用Image J 1.46R 軟件隨機選取支架材料掃描電鏡圖片中的30 個孔隙，測量每一孔隙最大直徑，以其平均值為支架材料的平均孔徑。

1.4.2 支架材料的吸水性和保水性

稱取一定量的復合材料(W0)，置于盛有足量待洗蒸餾水的燒杯中，放置24 h 至吸液飽和后用160目篩網(wǎng)濾去剩余蒸餾水和可溶物質(zhì)，準確測定吸水后復合材料的質(zhì)量(W1);將吸水后的的復合材料置于底層鋪有濾紙的離心管中，500 rpm 常溫離心3 min，取出濾紙上層材料，準確稱重(W2)。復合材料的吸水性(U)和保水性(R)按下列公司計算得到:

U=(W1-W0)/W0×100%

R=(W2-W0)/W0×100%

1.4.3 支架材料的離體降解性

配置0.1 mol/L PBS(pH 7.2)緩沖液，稱取一定量(W0)的復合材料置于密封管中，加入適量的PBS 緩沖液，稱取適量材料分別加入10 mL 的PBS緩沖液(pH 7.4)，置于電熱恒溫水浴箱中37 ℃溫度下降解，每星期更換一次緩沖液，傾出的緩沖液測量pH 值變化，樣品經(jīng)真空抽濾并用蒸餾水多次洗滌，再經(jīng)真空干燥箱冷凍干燥，測量其重量變化。

WL=(W0-W1)/W0×100%

2 實驗結(jié)果

2.1 γ-聚谷氨酸/殼聚糖復合材料的紅外圖譜分析

圖3 羥甲基殼聚糖(a)、γ-聚谷氨酸(b)和γ-聚谷氨酸/羥甲基殼聚糖(c)的紅外光譜圖Fig.3 The infrared spectra of CS (a)，γ-PGA (b)and γ-PGA/CMCS copolymer (c)

由圖3-a(CS 的紅外圖譜)可見:3429.2 cm-1處為O-H 和N-H 的伸縮振動，2923 cm-1處為-CH、-CH2的伸縮振動，1648.8 cm-1處為酰胺鍵C =O 的伸縮振動，1312.3 cm-1處為N-H 的剪式振動，1068.5 cm-1為C-O 的伸縮振動，這些特征吸收峰符合殼聚糖的主要官能團;由圖3-b(聚谷氨酸的紅外圖譜)可見:3295 cm-1處為O-H 和N-H 的伸縮振動，2941.2 cm-1處為-CH，-CH2的伸縮振動，1707.2 cm-1羧基中C=O 的伸縮振動，1596.5 cm-1亦為羧酸上C =O 的伸縮振動，由于結(jié)構(gòu)中的大π 鍵的共軛效應(yīng)使其吸收峰向低波數(shù)處移動，1406.6 cm-1處為N-H 的剪式振動，這些特征吸收峰符合γ-PGA 的主要官能團;

由圖3-c(合成的γ-PGA/CS 的圖譜)可見:3423.2 cm-1處為O-H 和N-H 的伸縮振動，3068.7 cm-1和2935. 6cm-1處 為-CH、-CH2的 伸 縮 振 動，1648.2cm-1處系酰胺基中-C =O 的伸縮振動帶(酰胺吸收帶I)，1560.6 cm-1 吸收帶來源于NH 彎曲和C-N 伸縮振動的偶合(酰胺吸收帶Ⅱ)，兩者結(jié)合證明了酰胺基的存在。1400.2 cm-1和1307.8 cm-1 處的吸收峰表明了分子結(jié)構(gòu)中存在脂肪烴類-CH2或-CH3(彎曲振動)。通過與γ-PGA 紅外圖譜對比(圖3-b)及圖譜解析可知殼聚糖和聚谷氨酸之間通過殼聚糖的氨基和聚谷氨酸的羧基生成的酰胺鍵而連接在一起。

2.2 支架材料形貌學特點

大體觀察，制備的支架材料質(zhì)地均勻一致，并富有彈性，呈海綿狀。掃描電鏡觀察，空隙分布均勻，各空隙的孔壁厚度一致。平均孔徑100.29 ±40.46 μm，孔隙率83.45%。眾多實驗證明成骨細胞生長要求材料的最佳孔徑為5～15 μm，骨再生為100～350 μm，而骨質(zhì)的生長為40～100 μm，考慮到各種因素認為能引導骨生長的支架最佳孔徑應(yīng)為200～350 μm［5］。在本實驗中，制備的材料的孔徑范圍達到了使得細胞順利進入并良好生長以及誘導骨礦化成骨的孔徑范圍的要求。但是除了孔徑大小，孔隙率和孔的連通性，也是實驗中考慮的因素之一，本材料有待進一步精度加工，使其帶到骨組織生長的最佳要求。

圖4 γ-聚谷氨酸/殼聚糖復合材料的表面掃描電鏡圖Fig.4 The surface morphology of the composite materials γ-PGA/CMCS

2.3 支架材料吸水性和保水性

通過24 h 的吸水測試，該復合材料的平均吸水性為465% ±38%，500 rpm 離心3 min 后保水性能達到329% ±33%。羥基殼聚糖和聚谷氨酸均溶解于水。因此無法比較吸水性和保水性。

人工骨的親水和疏水性與生物相容性有關(guān)。一般疏水性表面比親水性表面吸附蛋白量少，容易引起白蛋白變性;親水性表面不但容易吸附蛋白質(zhì)，而且粘附血小板的能力也小。該復合材料有很高的吸水性。由于用EDC/NHS 交聯(lián)的支架材料表面具有較多的極性基團，因此，也提高了支架材料的親水性，使支架材料的吸水量增加。

2.4 支架材料的體外降解性

降解介質(zhì)pH 值的變化:圖5 為不同材料體外降解實驗pH 值的變化。從圖5 可知，我們將羧甲基殼聚糖的初始pH 值較高(7.23)，隨著時間的推移，CMCS 逐漸緩慢降解，pH 也逐漸緩慢下降，潛到12 周時，pH 為6.8，整個過程pH 為同一趨勢變化。而γ-PGA/CMCS 復合材料在前4 周pH 值下降較快速，到5 周，下降減緩，并且后期維持較緩慢的降解，12 周緩慢下降至6.67。

材料失重率變化:圖6 為2 種材料降解過程中失重率變化圖。與pH 值變化相似，CMCS 的失重率在前7 周一直緩慢上升，7 周變化緩慢;γ-PGA/CMCS 復合材料在前4 周，失重率快速上升，降解較快，5～7 周降解趨于平緩，8 周后又降解加快，12 周是失重率達到12.96%。

跟其他聚合材料相似，復合材料降解的早期主要是許多小分子量的聚谷氨酸迅速降解，引導大分子量的聚谷氨酸分子迅速水解，而且分子鏈上每個酰鍵都可能被水解斷裂，分子鏈越長，被水解的部位也就越多，所以在開始階段降解快，pH 值下降明顯;隨著降解的進行，小分子量的γ-聚谷氨酸已經(jīng)完全降解，只剩下分子量分布較窄的中等分子量的分子降解，于是降解速度減慢。對于共聚物，降解結(jié)果可能是γ-聚谷氨酸、羥甲基殼聚糖的綜合作用，殼聚糖在酸的催化作用下，降解加快。故在降解初期，共聚物的pH 值下降明顯(0～4 周)，降解失重率也在顯著增加(0～4 周);隨著降解的進行，共聚物中的CS 中的胺基在酸的作用下，都會從共聚物中脫離而進入PBS 中，使溶液的pH 值有所上升(4～8 周)，這樣就相對抑制了γ-PGA 及CS 的降解，使降解減慢，失重率變緩(4～8 周);隨著降解的深入，CS 中的胺基逐漸與γ-PGA 中的COO-結(jié)合成鹽，但γ-PGA 還在繼續(xù)降解，COO-的不斷增加，使溶液pH值又緩慢下降(8～12 周)，但此時的γ-PGA 均為大分子量的，故其降解較慢，所以失重變得更緩(8～12 周)。精確的速度調(diào)解尚需要進一步研究。

3 結(jié)論與討論

本研究通過接枝共聚法成功合成了γ-聚谷氨酸/殼聚糖的共聚高分子并初步研究其結(jié)構(gòu)、性能。通過掃描電子顯微鏡SEM 觀察，可明顯觀察到空隙相連蜂窩狀結(jié)構(gòu)，具有很高的孔隙率，可達到83.45%，平均孔徑為100.29 ±40.46 um，氣孔比較均勻，孔徑可達到骨組織長入人工材料最小長入值的要求，但是孔隙率和孔的連通性需要進一步精度加工，使其帶到骨組織生長的最佳要求。該復合材料具有很好的吸水性和保水性，吸水性能達到465% ±38%，500 rpm 離心3 min 后保水性能達到329% ±33%。將材料浸泡于PBS 緩沖液(pH 值7.2)中靜置于37 ℃恒溫箱，經(jīng)過12 周的觀察，γ-聚谷氨酸/羥甲基殼聚糖復合材料的降解速率快于羥甲基殼聚糖，但是復合材料的降解是兩種材料綜合作用的結(jié)果，這方面有待于進一步深入的研究。

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