不同產(chǎn)地懷牛膝β－蛻皮甾酮含量測(cè)定及指紋圖譜研究

張留記 ，孫丹丹，屠萬(wàn)倩，劉欽松

1河南中醫(yī)學(xué)院，鄭州450008;2河南省中醫(yī)藥研究院，鄭州450004

牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，是中國(guó)藥典2010 年版一部收載品種，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、通血脈、降血壓及鎮(zhèn)痛等功效［1］，用于經(jīng)閉、痛經(jīng)、腰膝酸痛、筋骨無(wú)力、淋癥、水腫、頭痛、眩暈、牙痛、口瘡、吐血、衄血等癥的治療［2］。牛膝主產(chǎn)于河南焦作(古懷慶府)，是河南“四大懷藥”之一，種植歷史悠久、質(zhì)量?jī)?yōu)良、產(chǎn)量較大，被認(rèn)為《本經(jīng)》所載上品牛膝［3］。作為大宗常用中藥品種，牛膝的市場(chǎng)需求量較大，在我國(guó)河北、山東、內(nèi)蒙、安徽等不同地區(qū)也有規(guī)?；N植。牛膝中含有甾體、甾酮、皂苷、異黃酮和多糖等多種成分［4-6］，其中β-蛻皮甾酮(β-ecdysterone，EDS)為含量較高的三萜甾酮類成分。研究表明，牛膝中的三萜及蛻皮甾酮有抑制破骨細(xì)胞分化、促成骨樣細(xì)胞增殖活性，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成作用;抑制由于藥物引起的血糖升高，降膽固醇作用;使受損的細(xì)胞再生，與牛膝“補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨”功效相吻合［7，8］。中國(guó)藥典2010 年版一部中牛膝藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用HPLC 法建立了β-蛻皮甾酮的含量測(cè)定方法［9］?？紤]到懷牛膝藥材中化學(xué)成分較復(fù)雜，單一化學(xué)成分的含量測(cè)定不能全面反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量，指紋圖譜技術(shù)能較好的表征中藥的整體特征性，兼具一定的模糊性，已有對(duì)武陟等河南出產(chǎn)的牛膝進(jìn)行了指紋圖譜的研究報(bào)道［10，11］，但實(shí)驗(yàn)樣品僅局限于河南主產(chǎn)的部分懷牛膝樣品，對(duì)國(guó)內(nèi)其他產(chǎn)地的牛膝未進(jìn)行測(cè)定和比較。本文對(duì)不同產(chǎn)地的牛膝藥材中β-蛻皮甾酮進(jìn)行了含量測(cè)定，根據(jù)HPLC 色譜建立了懷牛膝的指紋圖譜，在同一色譜條件下完成牛膝的定性定量，為今后懷牛膝的質(zhì)量評(píng)價(jià)和道地性研究提供參考。

1 材料

美國(guó)Waters 高效液相色譜儀(2695 溶劑管理系統(tǒng)，2996 二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)Waters 柱溫箱，Empower II 工作站);Waters SunFire C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);AE240 十萬(wàn)分之一分析天平(瑞士METTLER 公司);LIBROR-160DPT 萬(wàn)分之一分析天平(日本島津);甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)Merck 試劑公司)，其余試劑為分析純，蒸餾水購(gòu)自鄭州市大成蒸餾水廠，重蒸餾水自制。對(duì)照品β-蛻皮甾酮(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):111638-200301，為含量測(cè)定用對(duì)照品)。懷牛膝對(duì)照藥材購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào):1006-2002203);供試藥材來(lái)源見(jiàn)1，經(jīng)河南省中醫(yī)藥研究院都恒青研究員鑒定均為莧科植物牛膝A.bidentata Bl.的干燥根，憑證標(biāo)本存放于河南省中醫(yī)藥研究院中藥室。

表1 不同產(chǎn)地的牛膝藥材來(lái)源Table 1 Samples of A.bidentata Bl.from different areas

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters SunFire C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相A:甲醇，流動(dòng)相B:水，柱溫30 ℃;流速1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm;記錄時(shí)間90 min;進(jìn)樣量10 μL。

表2 梯度洗脫時(shí)間程序Table 2 Gradient elution profile of mobile phases

2.2 供試品溶液的制備

取懷牛膝粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，加甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減輕的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL 溶解后，用水飽和的正丁醇提取5 次，每次10 mL，合并正丁醇液，用水15 mL 洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取β-蛻皮甾酮對(duì)照品1.30 mg 置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL 含β-蛻皮甾酮0.13 mg 的溶液，以0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.4 β-蛻皮甾酮含量測(cè)定

2.4.1 線性關(guān)系考察

取“2.3 對(duì)照品溶液的制備”項(xiàng)下制得的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣2、5、10、15、20 μL，按“2.1 色譜條件”測(cè)定β-蛻皮甾酮色譜峰峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行回歸處理，得回歸方程:Y=1.59 ×106X-2.26 ×104，r =0.9994。結(jié)果表明，β-蛻皮甾酮在0.26 μg～2.60 μg 范圍內(nèi)，進(jìn)樣量與峰面積之間呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品(β-蛻皮甾酮含量為0.634 mg/g)，取約0.5 g，精密稱定，置三角燒瓶中，精密加入濃度為0.00584 mg/mL 的β-蛻皮甾酮對(duì)照品溶液50 mL，以下按“2.2 供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，制備加樣回收供試品溶液。精密吸取加樣回收供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，按“2.1色譜條件”測(cè)定加樣供試品溶液中β-蛻皮甾酮的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 β-蛻皮甾酮的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Recoveries of β-ecdysterone

2.4.3 不同產(chǎn)地懷牛膝中β-蛻皮甾酮含量測(cè)定

取不同產(chǎn)地懷牛膝樣品，按“2.2 供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，分別測(cè)定其含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同產(chǎn)地懷牛膝藥材β-蛻皮甾酮含量測(cè)定結(jié)果Table 4 Quantification results of β-ecdysterone in samples from different areas

0.5803 0.058 3 0.5354 0.054 4 0.6537 0.065 5 0.5116 0.051 6 0.6114 0.061 7 0.7175 0.072 8 0.6116 0.061 9 0.6349 0.063 10 0.6228 0.062 11 0.6137 0.061 2

12 0.6337 0.063 13 0.6998 0.070 14 0.7708 0.077 15 0.6277 0.062 16 0.6045 0.060 17 0.4652 0.046 18 0.4810 0.048 19 0.5649 0.056 20 0.7240 0.072 21 0.4880 0.049

2.5 HPLC 指紋圖譜研究

2.5.1 精密度試驗(yàn)

取5 號(hào)樣品，按“2.2 供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，按“2.1 色譜條件”項(xiàng)下方法，連續(xù)6 次進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD 值，結(jié)果各共有峰的RSD 值均小于3%，表明精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取5 號(hào)樣品，按“2.2 供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算其各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD 值，結(jié)果RSD 值均小于3%，表明12 h 內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取5 號(hào)樣品粉末6 份，每份約1 g，按“2.2 供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，平行制備6 份供試品溶液。分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算其各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積的RSD 值，結(jié)果RSD 值均小于3%，表明本實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.5.4 懷牛膝的HPLC 色譜檢測(cè)

按“2.2 供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，對(duì)15 批來(lái)自河南道地產(chǎn)區(qū)的懷牛膝藥材和6 批來(lái)自其他不同產(chǎn)地的牛膝藥材進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖。β-蛻皮甾酮對(duì)照品溶液(EDS)及牛膝對(duì)照藥材(S11)HPLC 色譜圖見(jiàn)圖1。編號(hào)為1～9、12～17 的15 批道地懷牛膝藥材供試品的HPLC 色譜疊加圖(S1—S9，S12—S17)，見(jiàn)圖2。編號(hào)為10 的半野生牛膝(S10)、編號(hào)為11 的牛膝對(duì)照藥材(S11)和編號(hào)為18～21 的5 批其他產(chǎn)地的牛膝藥材供試品的HPLC 色譜疊加圖(S18—S21)，見(jiàn)圖3。

2.6 指紋圖譜的建立

2.6.1 參照峰的選擇

將懷牛膝對(duì)照品色譜圖與樣品色譜圖中保留時(shí)間相對(duì)應(yīng)的色譜峰的紫外吸收光譜進(jìn)行比較，結(jié)果完全一致，供試品色譜圖中3 號(hào)特征峰確定為β-蛻皮甾酮。各批次樣品圖譜中β-蛻皮甾酮的色譜峰分離良好，峰面積較大且為所有樣品共有，所以選擇β-蛻皮甾酮為參照峰。

2.6.2 不同產(chǎn)地懷牛膝藥材指紋圖譜及相似度評(píng)價(jià)

運(yùn)用藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版軟件進(jìn)行分析，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件，設(shè)定同一時(shí)期采集的同為二等品的12、13、14、15、16 號(hào)為參照?qǐng)D譜，將色譜峰自動(dòng)匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜(見(jiàn)圖1、圖3 中的R)，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。通過(guò)中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件得出道地懷牛膝藥材指紋圖譜的共有模式(即對(duì)照?qǐng)D譜)，各樣品與該共有模式比較，其相似度結(jié)果如下:1—11 號(hào)分別為0.999、0.998、0.998、0.999、0.998、0. 998、0. 999、0. 958、0. 987、0. 985、0. 982。17—21 號(hào) 分 別 為0. 971、0. 949、0. 947、0. 979、0.916。通過(guò)建立懷牛膝藥材的HPLC 指紋圖譜，確定了7 個(gè)共有峰，以3 號(hào)共有峰牛膝β-蛻皮甾酮為參照峰，計(jì)算21 批懷牛膝藥材其他共有峰的相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 21 批牛膝藥材共有峰相對(duì)峰面積比值Table 5 Relative peak area of the 7 common peaks of 21 batches of A.bidentata Bl.

3 討論

3.1 測(cè)定方法和儀器的選擇

考慮到HPLC 方法成熟，儀器普及率較高，利用該儀器建立懷牛膝中β-蛻皮甾酮含量測(cè)定方法和指紋圖譜方法，對(duì)儀器設(shè)備的要求相對(duì)較低，所建立方法易重復(fù)、易推廣，而UPLC、HPLC-MS/MS、HPLC-TOF-MS、UPLC-MS/MS 等先進(jìn)分析儀器價(jià)格昂貴，普及率相對(duì)較低，本文所采用的方法具有普遍適用性的特點(diǎn)。

3.2 供試品提取溶劑、提取方法的選擇

在實(shí)驗(yàn)中，試用了甲醇、水飽和正丁醇、95%乙醇等不同提取溶劑制備供試品溶液。結(jié)果表明，以甲醇作為提取溶劑，HPLC 色譜峰較為豐富，提取β-蛻皮甾酮較為完全，故選擇甲醇作為提取溶劑。對(duì)加熱回流、超聲處理、索氏提取等不同提取方式進(jìn)行考察，結(jié)果三種方式提取效率相仿，但超聲具有提取快速、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，故采用超聲為供試品溶液的提取方法。在試驗(yàn)中，還比較了20、30、50 min 等不同超聲處理時(shí)間，結(jié)果超聲處理20 min 的供試品色譜吸收明顯弱于超聲30 min 和50 min 供試品，超聲處理30 min 的圖譜與50 min 的圖譜色譜峰數(shù)量、峰面積基本一致，提取30 min 后，各成份已基本提取完全。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇以甲醇溶劑，超聲提取30 min 作為提取方法。為獲得理想的色譜條件，在供試品制備過(guò)程中，根據(jù)β-蛻皮甾酮等植物甾酮的理化性質(zhì)，甲醇超聲處理后，經(jīng)水飽和正丁醇萃取和水洗滌等精制除雜步驟，樣品中主要特征峰分離度良好，峰型對(duì)稱。

3.3 色譜條件的選擇

為獲得更豐富的色譜峰信息，在實(shí)驗(yàn)中先后比較了乙腈-1%甲酸溶液、乙腈-0.4%磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-0.4%磷酸溶液和甲醇-水等多種色譜系統(tǒng)和梯度洗脫程序，結(jié)果采用甲醇-水系統(tǒng)，按本文選定的時(shí)間程序洗脫，各色譜峰的分離度較好，且峰形對(duì)稱性好。

3.4 掃描波長(zhǎng)的選擇

采用二極管陣列檢測(cè)器在200 nm～400 nm 對(duì)供試品色譜進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到三維全波長(zhǎng)紫外掃描圖，結(jié)果表明在250 nm 波長(zhǎng)處各吸收峰吸收均較強(qiáng)，且懷牛膝主要特征成分β-蛻皮甾酮在此處響應(yīng)值較高，故選擇250 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.5 柱溫的選擇

考查了不同溫度(室溫、40 ℃、30 ℃)對(duì)色譜峰的影響，室溫出峰時(shí)間較長(zhǎng)，部分吸收峰有輕微拖尾，柱溫40 ℃時(shí)出峰較迅速，1、2、4 號(hào)峰等主要色譜峰與相鄰峰未能達(dá)到基線分離，30 ℃時(shí)色譜峰保留時(shí)間相應(yīng)延長(zhǎng)，但分離較好，出峰時(shí)間適宜，因此選擇柱溫為30 ℃。

3.6 道地與非道地產(chǎn)區(qū)懷牛膝β-蛻皮甾酮含量分析

運(yùn)用SPASS 13.0 軟件，對(duì)道地和非道地懷牛膝中β-蛻皮甾酮含量進(jìn)行分析，道地產(chǎn)區(qū)藥材含量高于非道地產(chǎn)區(qū)藥材，通過(guò)F 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地間懷牛膝中β-蛻皮甾酮含量無(wú)顯著性差異。

3.7 不同等級(jí)懷牛膝中β-蛻皮甾酮含量分析

運(yùn)用SPASS 13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對(duì)四個(gè)不同等級(jí)懷牛膝藥材中β-蛻皮甾酮含量分別進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二等品＞三等品＞一等品＞四等品;在P=0.05 的水平下，四等懷牛膝中β-蛻皮甾酮含量與三等和二等懷牛膝中含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;其他水平間的含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.8 建立懷牛膝藥材的HPLC 指紋圖譜

在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)來(lái)自道地藥材產(chǎn)區(qū)不同產(chǎn)地的懷牛膝進(jìn)行指紋圖譜研究，建立了懷牛膝中甾酮類成分的HPLC 指紋圖譜對(duì)照?qǐng)D譜;通過(guò)對(duì)15 批來(lái)自不同產(chǎn)地的懷牛膝進(jìn)行測(cè)定和分析，所建立的對(duì)照指紋圖譜具有一定代表性，能夠反映懷牛膝中β-蛻皮甾酮等甾酮類化合物的組成及相對(duì)比例，既可用于定性鑒別，又可起到半定量分析的作用，為河南道地藥材懷牛膝的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新的科學(xué)方法和數(shù)據(jù)。

3.9 相似度分析

應(yīng)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A 版)進(jìn)行圖譜分析，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地牛膝的相關(guān)系數(shù)有一定的差異。河南道地藥材懷牛膝相似度均大于0.95，而河北、亳州等其他產(chǎn)地的牛膝的相似度則低于0.95，本實(shí)驗(yàn)所建方法可為區(qū)分道地藥材和非道地藥材提供一定的參考依據(jù)。

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