高速逆流色譜分離純化鉤吻中鉤吻素甲

劉 浩，沈 潔，劉 銘，許 盈，俞昌喜*

1福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，福州350004;2 武警福建總隊醫(yī)院藥劑科，福州350003

中國鉤吻為馬錢科植物胡蔓藤的全草，盛產(chǎn)于浙江、福建、廣東、廣西、湖南、貴州、云南等地［1］，本地區(qū)資源豐富。我國民間一直應(yīng)用鉤吻原植物治療各類疼痛，尤其慢性神經(jīng)性疼痛與癌性疼痛。鉤吻主要有效成分為吲哚類生物堿。臨床和基礎(chǔ)研究表明，鉤吻總生物堿具有顯著的抗腫瘤、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、促進(jìn)造血、抑制血小板聚集、免疫抑制等藥理作用［2，3］，但是治療量卻與中毒量較接近，限制了臨床應(yīng)用。因此，從鉤吻總堿中分離得到高效低毒的生物堿單體成為新藥研發(fā)的目標(biāo)。

從20 世紀(jì)30 年代起，我國學(xué)者趙承嘏等先后完成了鉤吻化學(xué)成分分析方面的研究［4-7］，鉤吻素甲是鉤吻生物堿中含量最高的兩種單體之一，且毒性相對較低［8］，使其研發(fā)成為可能，但是傳統(tǒng)采用的分離方法主要是堿性硅膠柱或氧化鋁柱色譜［4-7］，分離周期長，溶劑消耗大，得率低。本文采用的高速逆流色譜(high-speed counter current chromatography，HSCCC)是一種基于液液分配機(jī)理的新型色譜分離純化技術(shù)，可避免液固色譜造成的固體載體對樣品的不可逆吸附，分離效率高、周期短、回收率高、制備量大［9］。本文首次采用HSCCC 技術(shù)分離純化鉤吻素甲，以建立鉤吻素甲的一種高效分離純化的制備技術(shù)。

圖1 鉤吻素甲的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of gelsemine

1 材料與儀器

TBE-300A 高速逆流色譜儀(中國上海同田生化技術(shù)有限公司);TBP-50A 恒流泵(上海同田生物技術(shù)有限公司);TBD-23 紫外檢測器(上海同田生物技術(shù)有限公司);DBS-100 電腦全自動部分收集器(上海青浦滬西儀器廠);HX-1050 恒溫循環(huán)器(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);1100 高效液相色譜儀(美國Angilent 公司);依利特Hypersil ODS2 高效液相色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)(大連依利特分析儀器有限公司);Avance III 400 MHz 核磁共振儀(瑞士Bruker 公司);LCQ 離子阱質(zhì)譜儀(美國Finnigan Thermo Electron 公司)。

鉤吻原生藥材采集于福州市，經(jīng)過本課題組生藥學(xué)研究鑒定為中國鉤吻的全草［10］。實驗中所用的乙醇、氯仿、甲醇為分析純，購自天津巴斯夫化工有限公司;高效液相色譜(HPLC)分析用甲醇為色譜純，購自中國國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;實驗用水為自制重蒸水。

清潔級ICR 小鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號:SCXK(滬)2009-0005。體重18～23 g。光暗周期12/12 h(光照時間8:00～20:00)下恒溫(23 ±2 ℃)、恒濕度(50 ±5%)環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲水飲食。所有針對小鼠的實驗操作都遵守國際和本地實驗動物使用和保護(hù)委員會頒布的條例。

2 方法與結(jié)果

2.1 鉤吻粗提物的制備

取曬干的鉤吻植物的根和莖適量，粉碎后過40目篩，稱取鉤吻粗粉500 g，加入3000 mL 95%乙醇中浸泡過夜，用90 ℃水浴加熱回流提取3 小時后，過濾，重復(fù)上述步驟，共回流提取3 次，合并濾液，45℃減壓蒸餾至無醇味，呈深棕色浸膏狀。加入2%鹽酸300 mL 溶解浸膏，調(diào)節(jié)pH 為2，放置過夜。將前一天靜置的溶液抽濾，濾渣(變?yōu)樯罹G色)再加入100 mL 2%鹽酸振搖后抽濾，合并濾液;濾液用50 mL 乙醚萃取，除去脂質(zhì)和色素;乙醚重復(fù)萃取1 次后，沿玻棒緩慢加入100 mL 5 mol/L NaOH，使pH大于11，生成紅棕色沉淀;然后用氯仿和乙酸乙酯分別萃取3 次，合并萃取液，45 ℃減壓蒸餾后獲得鉤吻總堿浸膏3.06 g，提取率為0.61%。

2.2 HSCCC 溶劑體系的選擇

采用HSCCC 分離天然產(chǎn)物中的化學(xué)成分，溶劑體系的選擇至關(guān)重要。目前常用HPLC 法測定組分在不同溶劑體系中的分配系數(shù)來指導(dǎo)溶劑體系選擇:配制各種比例溶劑體系，靜置2 h。取適量鉤吻總生物堿提取物，加入兩相體系中的下相中充分溶解，用HPLC 法測定下相中目標(biāo)單體的峰面積(A1)。然后再加入等體積上相，將上下兩相劇烈振蕩充分混合，待生物堿在兩相中分配完全后，測定下相中目標(biāo)單體的峰面積(A2)。HPLC 測定時兩次下相的進(jìn)樣體積相同。計算分配系數(shù)［K =(A1-A2)/A2］，K 值一般在0.2 到2 之間，以1 左右為宜，各組分分離因子(各組分K 值比)應(yīng)大于1.5［11］。這樣選定的溶劑體系只是初步估計，與HSCCC 實際結(jié)果可能還存在出入。

本研究根據(jù)鉤吻生物堿的化學(xué)性質(zhì)，考慮到鉤吻總堿中組分較多，經(jīng)過摸索，選擇分離中等極性化合物的溶劑體系:正己烷-乙酸乙酯-無水乙醇-水體系和氯仿-甲醇-0.2 mol/L HCl 體系，取得了較好的分離效果。

2.3 HSCCC 儀器參數(shù)的優(yōu)化

影響分離效果的儀器參數(shù)包括泵的流速、主機(jī)轉(zhuǎn)速、恒溫浴槽的循環(huán)水溫。

2.3.1 泵的流速

流速越快則分離時間越短，分離效果越不理想;流速越慢則分離效果越好，分離時間越長。本課題組考察了1.0、1.5、2.0 mL/min 等流速，其中流速為1.5 mL/min 時分離效果最好。

2.3.2 主機(jī)的轉(zhuǎn)速

由于兩相溶劑體系容易產(chǎn)生氣泡，為了盡量減少氣泡對分離效果和儀器管路造成的不利影響，實驗之前先將上下相超聲脫氣30 min，同時在不影響分離效果的前提下盡量減慢轉(zhuǎn)速，實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)速850 rpm 比較合適。

2.3.3 循環(huán)水溫

循環(huán)水溫對分離效果影響不大，最終選用常溫25 ℃作為分離溫度。

2.4 鉤吻素甲的分離純化

配制正己烷-乙酸乙酯-無水乙醇-水(3:3:2:3 V/V)為溶劑體系，充分混勻后靜置過夜。使用前分離溶劑體系的上下相，上相為固定相，下相為流動相，分別超聲30 min。300 mg 鉤吻總堿超聲溶解在15 mL 下相中備用。將上相泵入高速逆流色譜儀主機(jī)，待上相從管道出口流出時，開啟恒溫循環(huán)器，調(diào)節(jié)溫度至25 ℃，設(shè)定流速為1.5 mL/min，泵入下相，同時開啟HSCCC 主機(jī)，由首端向尾端正轉(zhuǎn)洗脫，轉(zhuǎn)速為850 rpm。當(dāng)流動相從主機(jī)出口流出，表明體系已經(jīng)達(dá)到流體動力學(xué)平衡，此時將樣品倒吸入儀器螺旋管柱內(nèi)，檢測波長為254 nm。應(yīng)用N2000 色譜工作站采集紫外吸收信號，并根據(jù)色譜峰分段收集樣品，上相保留率為71.3%。

將收集到的鉤吻HSCCC 峰組分進(jìn)行HPLC 分析，色譜條件參照2.6.1 項，根據(jù)HPLC 分析結(jié)果，將只含有目標(biāo)成分I 與另一成分II 的收集液合并，于45 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑后，作為新的分離樣品。

配置氯仿-甲醇-0.2 mol/L HCl(4:3:1.5 V/V)溶劑體系，參照上述HSCCC 操作(上相保留率為66%)，將主要含有兩個組分的新分離樣品進(jìn)行進(jìn)一步分離，經(jīng)HPLC 檢測分析(色譜條件參照方法2.6.1 項)，將高純度的目標(biāo)組分HSCCC 洗脫液合并，采用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法濃縮樣品，真空干燥獲得白色固體粉末。300 mg 鉤吻總堿粗品經(jīng)兩次HSCCC 分離純化，可得到30.78 mg 單體。其HSCCC 分離過程的色譜圖見圖2、圖3。

2.5 質(zhì)譜和核磁共振分析

對分離得到的鉤吻單體選用質(zhì)譜、核磁共振氫譜、碳譜等分析方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。

ESI-MS m/z 323.4 (M+H+)，其相對分子質(zhì)量應(yīng)為322.4;1H NMR (CDCl3，TMS)δ:3.82 (1H，s，H-3)，2. 76 (3H，s，Nb-CH3)，4. 11 (1H，s，H-5)，2.26 (1H，s，H-6)，7.42 (1H，d，H-9)，7.19 (1H，t，H-10)，7. 27 (1H，t，H-11)，7. 01 (1H，t，H-12)，2.84 (1H，d，H-14α)，2.00 (1H，ddd，H-14β)，2.44(1H，t，H-15)，2.97 (1H，s，H-16)，4.10 (2H，s，H-17)，5. 10 (1H，d，H-18a)，4. 95 (1H，d，H-18b)，6.25 (1H，dd，H-19)，2. 84 (1H，d，H-21β)，3. 45(1H，s，H-21α);13C NMR (CDCl3，TMS)δ:178. 9(C-2)，140.2 (C-13)，138.6 (C-19)，131.9 (C-8)，128.4 (C-9)，128.0 (C-11)，121.9 (C-10)，112.3(C-18)，109.0 (C-12)，72.2 (C-5)，69.5 (C-3)，66.3 (C-21)，61.6 (C-17)，54.1 (C-7)，54.1 (C-20)，50.7 (N-CH3)，40.8 (C-6)，38.3 (C-15)，35.8(C-16)，22.9 (C-14)。經(jīng)與文獻(xiàn)報道［12，13］數(shù)據(jù)對照，確定該化合物為鉤吻素甲。

2.6 組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的HPLC 法測定

2.6.1 色譜條件

色譜柱為依利特Hypersil ODS2 高效液相色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5μm)(大連依利特分析儀器有限公司);流動相為甲醇-0.2%正丁胺水溶液(50∶50);二極管陣列檢測器;體積流量為1.0 mL/min;檢測波長為256 nm;柱溫為25 ℃。

2.6.2 紫外法測定結(jié)果

經(jīng)HSCCC 分離得到的目標(biāo)組分在高效液相色譜190～600 nm 波長掃描發(fā)現(xiàn)，樣品在不同檢測波長中均為單一的色譜峰。

圖4 HSCCC 分離純化后得到的鉤吻素甲的HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of purified gelsemine

2.6.3 HPLC 法測定結(jié)果

采用面積歸一化法計算鉤吻素甲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97.76%，見圖4。

2.7 小鼠醋酸扭體法檢測鉤吻總堿與鉤吻素甲的鎮(zhèn)痛活性

小鼠醋酸扭體模型的建立:小鼠置于不透光的圓筒(直徑30 cm，高45 cm)內(nèi)適應(yīng)30 min，經(jīng)過藥物處理一定時間之后，每只小鼠腹腔注射0.2 mL(0.1 mL/10 g)0.6%冰醋酸，而后放入圓筒內(nèi)對小鼠進(jìn)行觀察。當(dāng)小鼠出現(xiàn)典型的腹部內(nèi)凹，同時伴有軀干扭曲，臀部抬高以及后肢伸長等特征性反應(yīng)時，認(rèn)為是一次扭體的發(fā)生。記錄15 min 內(nèi)小鼠的扭體次數(shù)以反映小鼠的疼痛程度。實驗時室溫保持在22～26 ℃，實驗時間段一致，環(huán)境室溫22 ±1 ℃，濕度55 ±10%。

2.7.1 鉤吻總堿的鎮(zhèn)痛活性

在小鼠醋酸扭體模型的基礎(chǔ)上，觀察鉤吻總堿對醋酸誘導(dǎo)的炎性自發(fā)痛的影響:小鼠隨機(jī)分為生理鹽水對照組、鉤吻總堿高、中、低劑量組以及嗎啡對照組，每組10 只。鉤吻素甲高、中、低劑量組小鼠i.p.給予鉤吻總堿0.6、0.4、0.2 mg/kg，嗎啡對照組i.p.給予嗎啡10 mg/kg，生理鹽水對照組i.p.給予相同體積的生理鹽水，30 min 后各組動物i.p.給予0.6%冰醋酸10 mL/kg，觀察15 min 小鼠的扭體次數(shù)。結(jié)果見表1。

表1 鉤吻總堿對醋酸所致小鼠扭體行為的影響Table 1 Effect of the total alkaloids from G.elegan s on writhing behavior of mice induced by acetic acid

結(jié)果顯示，鉤吻總堿高、中、低劑量組與生理鹽水組相比，扭體次數(shù)明顯減少(P ＜0.001)，扭體抑制率呈劑量依賴性。嗎啡組扭體抑制，鎮(zhèn)痛作用顯著。提示鉤吻總堿可能具有較強(qiáng)的抗炎性疼痛作用，但其作用弱于嗎啡。

2.7.2 鉤吻素甲的鎮(zhèn)痛活性

在小鼠醋酸扭體模型的基礎(chǔ)上，觀察本實驗分離純化所獲得鉤吻素甲對醋酸誘導(dǎo)的炎性自發(fā)痛的影響:小鼠隨機(jī)分為生理鹽水空白對照組、鉤吻素甲高、中、低劑量組以及阿司匹林對照組，每組18～29只。鉤吻素甲高、中、低劑量組小鼠s. c. 給予鉤吻素甲10、2、0.4 mg/kg，阿司匹林對照組s.c.給予阿司匹林100 mg/kg，生理鹽水對照組s. c. 給予相同體積的生理鹽水，30 min 后各組動物i. p. 給予0.6%冰醋酸10 mL/kg，觀察15 min 小鼠的扭體次數(shù)。結(jié)果見表2。

表2 鉤吻素甲對醋酸所致小鼠扭體行為的影響Table 2 Effect of gelsemine on writhing behavior induced by acetic acid in mice

結(jié)果顯示，鉤吻素甲高、中、低劑量組與生理鹽水組相比，小鼠的扭體次數(shù)明顯減少(低劑量組P＜0.05，中劑量組P ＜0.01，高劑量組P ＜0.001)，且扭體抑制率呈劑量依賴性。阿司匹林組的扭體次數(shù)與生理鹽水組相比也顯著減少(P ＜0.001)。提示鉤吻素甲可能對炎性疼痛具有鎮(zhèn)痛作用。

3 討論

我國學(xué)者很早就完成了鉤吻生物堿單體化學(xué)成分方面的研究，但是后續(xù)的藥理方面的研究卻遲遲沒有展開，其重要原因之一可能就是由于當(dāng)時分離技術(shù)主要采用色譜柱層析［4-7］，分離周期長，溶劑消耗量大，得率低，可能分離得到的單體量比較少，不足以進(jìn)行后續(xù)研究。而本課題組在鉤吻單體制備工藝上取得了突破，采用先進(jìn)的高速逆流色譜技術(shù)進(jìn)行鉤吻生物堿的分離，前面已經(jīng)報道分離得到鉤吻素己和1-甲氧基鉤吻堿［14］，本實驗則把鉤吻素甲作為分離的目標(biāo)組分，一次進(jìn)樣300 mg 鉤吻總堿，經(jīng)過兩次HSCCC 可以分離得到高純度的鉤吻素甲30.78 mg，一次HSCCC 一天就可以完成，分離周期短，得率高，分離效果好，操作簡單，優(yōu)勢明顯。高速逆流色譜法為鉤吻生物堿單體的研發(fā)提供了一種高效的分離制備方法，為下一步的研究打下堅實的基礎(chǔ)。如果在制備型高速逆流色譜儀上進(jìn)行放大制備，進(jìn)樣量可以達(dá)到克～100 克量級，產(chǎn)量很大。在HSCCC 基礎(chǔ)上本課題組蘇燕評等嘗試采用pH 區(qū)帶精制逆流色譜(pH-zone-refining CCC)分離鉤吻總堿［15］，取得很好的效果，總堿進(jìn)樣量達(dá)到1 克，得到的單體量可達(dá)幾百毫克。因此，HSCCC 技術(shù)將有可能發(fā)展成為鉤吻生物堿產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的高效分離純化手段。我們還可以針對天然藥物分離工作中的特點，使用HSCCC 與其他技術(shù)相結(jié)合，例如正交軸逆流色譜(X-axis CPC)、雙向逆流色譜(DuCCC)以及上面提到的pH 區(qū)帶精制逆流色譜(pH-zone-refining CCC)等新技術(shù)，使其在生物堿分離純化方面的應(yīng)用更加廣泛。

小鼠醋酸扭體實驗?zāi)M的是一種腹腔炎癥所引起的疼痛狀態(tài)，醋酸所致扭體反應(yīng)持續(xù)時間在15 min 到1 h 左右，其內(nèi)臟炎性痛的機(jī)制較復(fù)雜。醋酸扭體實驗因其成本較低且操作簡單，現(xiàn)已成為一種經(jīng)典的用于鎮(zhèn)痛藥篩選的動物模型，其特點是無論對于中樞性鎮(zhèn)痛藥還是外周性鎮(zhèn)痛藥均具有較高的敏感性。本研究采用小鼠醋酸扭體模型對鉤吻總堿和鉤吻素甲的抗炎鎮(zhèn)痛活性進(jìn)行了初步探索，結(jié)果表明鉤吻總堿與鉤吻素甲均可明顯抑制小鼠扭體反應(yīng)，抗醋酸所致炎性疼痛作用呈劑量依賴性。

藥物從天然產(chǎn)物提取出來的過程中可能由于物理或者化學(xué)的作用生成外消旋體或者手性藥物，從而導(dǎo)致藥物活性的丟失。本實驗中鉤吻總堿的鎮(zhèn)痛活性顯著，鉤吻素甲經(jīng)過高速逆流色譜分離純化后，對小鼠炎性疼痛仍然具有明顯的鎮(zhèn)痛作用，說明提取過程藥物活性得到很好的保留，并沒有由于手性原因丟失鎮(zhèn)痛活性，提取方法高速有效，可以用于鉤吻生物堿的制備。

由于鉤吻總堿組分多，毒性強(qiáng)，雖有鎮(zhèn)痛作用，卻難于應(yīng)用于臨床。本課題組已分離得到鉤吻素己，但其被認(rèn)為是中國鉤吻生物堿中毒性最強(qiáng)的，且含量較少，應(yīng)用受到限制;本實驗分離得到的鉤吻素甲單體毒性較弱，含量很高，在中國鉤吻中的僅次于鉤吻素子［8］，具有潛在的解熱鎮(zhèn)痛抗炎活性，有望開發(fā)成新型的鎮(zhèn)痛藥。有關(guān)鉤吻素甲的藥理活性以及毒理作用，有待于今后進(jìn)一步研究。

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