鴉膽子中苦木內(nèi)酯類化合物的制備分離和化學(xué)表征

周中流 ，黃詩(shī)瑤，梁燕君，何妙玲，馮宗財(cái)，夏敬民

1湛江師范學(xué)院 化學(xué)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院制藥工程系;2 湛江師范學(xué)院 廣東高校新材料工程技術(shù)開發(fā)中心，湛江524048

鴉膽子為苦木科植物鴉膽子(Brncea Javaniea L.Merr)的灰黑色長(zhǎng)圓形或卵形的干燥成熟果實(shí)，是民間傳統(tǒng)常用中藥，該藥材原植物主產(chǎn)于我國(guó)南方沿海熱帶和亞熱帶地區(qū)。文獻(xiàn)報(bào)道［1，2］，中藥鴉膽子中主要含有苦木內(nèi)酯，脂肪酸和生物堿等成分。我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)將其用于清熱、燥濕、殺蟲、解毒。據(jù)報(bào)道，鴉膽子具有抗瘧、抗炎和抗腫瘤等作用［3］。

國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)有關(guān)鴉膽子活性成分的報(bào)道［1，2］，發(fā)現(xiàn)其果實(shí)中含有多種具有抗腫瘤活性的苦木內(nèi)酯類化合物。鴉膽苦素D 具有抗虐和抗腫瘤活性，鴉膽苦醇對(duì)S180瘤株有邊緣活性［1，2］。目前市場(chǎng)上還未有高純度的鴉膽苦素D、鴉膽苦醇和鴉膽因H 對(duì)照品，限制了鴉膽子的深入開發(fā)和應(yīng)用。本文采用制備型高效液相色譜法(Pre-HPLC)，在30 min 的分離時(shí)間內(nèi)完成分離，制備了鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H 三個(gè)成分。通過熔點(diǎn)測(cè)定法、高效液相色譜對(duì)獲得的產(chǎn)品進(jìn)行分析，產(chǎn)品純度達(dá)到98%以上，可以作為鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H 對(duì)照品使用。本方法制備的鴉膽苦素D，鴉膽苦醇與鴉膽因H 具有高效快速、產(chǎn)品純度高的特點(diǎn)，可以作為制備高純度的鴉膽苦素D，鴉膽苦醇及鴉膽因H 對(duì)照品提供參考。

1 儀器、試劑與材料

Waters Delta 4000 制備型高效液相色譜儀，Empower 色譜工作站;Waters 2695-2996 高效液相色譜分析儀，配二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters 公司);X-4 數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(北京泰克儀器有限公司);甲醇和乙腈均為色譜純(Fisher chemicals 公司);水為屈臣氏蒸餾水;其他試劑均為分析純。中藥鴉膽子粗提物經(jīng)AB-8 型大孔樹脂和硅膠柱層析自制。3 種苦木內(nèi)酯均為實(shí)驗(yàn)室自制(經(jīng)UV、NMR、MS、IR 鑒定，HPLC 純度不低于98%)，符合定量要求。中藥鴉膽子藥材購(gòu)自廣東，經(jīng)廣西師范大學(xué)生命科學(xué)院唐紹清教授鑒定為植物Brncea Javaniea L.Merr 干燥果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

制備型HPLC 條件:自填Microsorb C18柱(50 mm × 200 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水(體積比40∶60)，流速100 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm;進(jìn)樣量:2 mL。

分析型HPLC 條件:Microsorb C18色譜柱(4. 6 mm × 150 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇-水(體積比為40∶60)，流速1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 樣品處理

將10 kg 鴉膽子干燥果實(shí)，經(jīng)過95%乙醇回流提取，所得浸膏分散于水中，用石油醚萃取三次，殘余水液稀釋過AB-8 大孔吸附樹脂，依次用水、40%、95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫液，減壓蒸干，得到鴉膽子苦木內(nèi)酯粗提物450 g;苦木內(nèi)酯粗提物450 g 再經(jīng)過硅膠柱層析(100～200 目，柱長(zhǎng)45 cm，內(nèi)徑3 cm)，得到富含鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H 的干浸膏37 g。稱取該干浸膏10 g 甲醇溶解，配置成濃度為20 mg/mL 的溶液，過0.45 μm 微孔濾膜，供樣品分析和制備使用。

2.3 樣品分析

圖1 樣品的HPLC 圖Fig.1 HPLC chromatogram of sample

取按照“2.2”方法處理后的樣品溶液適量，用甲醇稀釋10 倍后進(jìn)行分析，以鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H 對(duì)照品為對(duì)照，對(duì)色譜圖中的峰進(jìn)行指認(rèn)，見圖1。

2.4 制備色譜條件的優(yōu)化

制備色譜條件的優(yōu)化從樣品的溶解開始。通過分析型色譜來優(yōu)化分離條件，然后應(yīng)用線性放大技術(shù)在制備色譜中放大。通過優(yōu)化色譜條件使目標(biāo)化合物與干擾成分在分析型色譜中的分離度Rs大于2，確保分析型色譜條件放大后經(jīng)簡(jiǎn)單調(diào)整即可在制備型色譜中達(dá)到滿意的效果。在用反相制備色譜制備對(duì)照品時(shí)，一般來說，小的保留因子k 對(duì)制備分離更有利。本實(shí)驗(yàn)中鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H 的k 分別約為2.3、4.5 和5.7。

制備色譜流動(dòng)相的流速、進(jìn)樣量分別按照公式計(jì)算:Fp=Fa× (Dp/Da)2，Lp=La× (Dp/Da)2(式中Fp為制備型色譜流動(dòng)相流速，F(xiàn)a為分析型色譜流動(dòng)相流速，Dp為制備柱的直徑，Da為分析柱的直徑，Lp為制備型色譜進(jìn)樣量，La為分析型色譜進(jìn)樣量)［4，5］。參照上述文獻(xiàn)報(bào)道的方法，并結(jié)合實(shí)際制備過程中的成本以及產(chǎn)品純度，進(jìn)一步調(diào)整得到了“2.1”下制備色譜的條件。

2.4.1 樣品溶解條件的選擇

選擇溶解樣品的溶劑，應(yīng)該對(duì)樣品有良好的溶解度，不干擾樣品的分離，且容易處理。本文比較了甲醇、乙腈、丙酮、水、二甲基亞砜等溶劑，發(fā)現(xiàn)樣品在甲醇中溶解度很好。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇為溶劑，配成濃度為20 mg/mL 的樣品溶液。

2.4.2 流動(dòng)相的選擇

分析型液相色譜向制備型液相色譜轉(zhuǎn)化時(shí)，本研究采用放大公式Xp= Xa· rp2· CL/ ra2(Xp為制備型色譜流速，Xa為分析型色譜流速，rp為制備型柱半徑，ra為分析型柱半徑，CL為制備型色譜柱與分析型色譜柱的長(zhǎng)度比)。通過優(yōu)化甲醇-水的比例、流動(dòng)相流速使樣品達(dá)到需要的分離效果。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)中分析與制備色譜柱的規(guī)格，制備色譜中流動(dòng)相理論流速應(yīng)為113 mL/min，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中采用的流速為100 mL/min。

2.4.3 最佳進(jìn)樣量的選擇

進(jìn)樣量的改變由樣品溶液的濃度和進(jìn)樣體積兩方面決定。在樣品濃度一定的情況下，通過增大進(jìn)樣體積來增大進(jìn)樣量。當(dāng)進(jìn)樣量增加時(shí)，目標(biāo)化合物與相鄰成分的分離度會(huì)逐漸降低，影響目標(biāo)化合物的分離，進(jìn)樣量達(dá)到一定量時(shí)，相鄰成分無法分離［5］。

在樣品質(zhì)量濃度為20 mg/mL 條件下，考察了不同進(jìn)樣體積(0.5～5 mL)對(duì)分離度的影響。結(jié)果表明，0.5～2 mL 進(jìn)樣體積范圍內(nèi)，目標(biāo)成分與干擾成分分辨率逐漸降低，峰重疊加重;當(dāng)進(jìn)樣體積大于2 mL 后，目標(biāo)成分與干擾成分重疊嚴(yán)重，無法選取適當(dāng)?shù)那懈钗恢?，使分離的純度無法保證。因此，本實(shí)驗(yàn)采用2 mL。

圖2 樣品制備HPLC 圖Fig.2 Preparative HPLC chromatogram of sample

2.5 產(chǎn)品純度的檢測(cè)

2.5.1 高效液相色譜分析

對(duì)照品定性分析，制備色譜所得的化合物為鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H，再經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)(按“2.1”部分分析型HPLC 條件)，采用峰面積歸一法，鴉膽苦素D 的純度為99.17%，鴉膽苦醇的純度為99.02%，鴉膽因H 的純度為98.75%。外標(biāo)法定量，測(cè)得的產(chǎn)品質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為:98.58%、98.03%和98.01%。

2.5.2 熔點(diǎn)的測(cè)定

測(cè)得所制備的鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H 的熔點(diǎn)分別為:285～286 ℃、272～274 ℃、283～284 ℃。

2.6 結(jié)構(gòu)鑒定

鴉膽苦醇:片狀結(jié)晶(甲醇-氯仿)，mp:272～274 ℃，F(xiàn)eCl3反應(yīng)呈陽性;1H NMR (400 MHz，C5D5N)δ :1.24 (3H，s，H-18)，2.10 (2H，m，H-6)，1.71 (3H，s，H-19)，1.90 (3H，s，H-4')，2.10 (3H，s，H-5')，2.13(1H，m，H-19)，2.14，3.16 (2H，m，H-1)，2.91 (1H，d，J = 12.6 Hz，H-5)，3.61，4.92(2H，m，H-20)，3.62 (3H，s，H-23)，4.01 (1H，m，H-11)，4.12 (1H，m，H-12)，4.90 (1H，m，H-7)，5.72 (1H，s，H-2')，5.90 (1H，m，H-15);13C NMR(100 MHz，C5D5N)δ :50.3 (C-1)，193.0 (C-2)，146.1 (C-3)，128.5 (C-4)，42.7 (C-5)，29.9 (C-6)，83.4 (C-7)，41.8 (C-8)，42.9 (C-9)，46.2 (C-10)，73.4 (C-11)，76.3 (C-12)，83.1 (C-13)，51.2(C-14)，68.4 (C-15)，168.1 (C-16)，16.3 (C-18)，13.5 (C-19)，74.7 (C-20)，171.2 (C-22)，53.1 (C-23)，165.4 (C-1')，116.3 (C-2')，158.4 (C-3')，20.4 (C-4')，

27.1 (C-5')。以上波譜數(shù)據(jù)和理化性質(zhì)與文獻(xiàn)［6，7］報(bào)道的鴉膽苦醇基本一致。

鴉膽苦素D:無色粉末，mp:285～286 ℃，F(xiàn)eCl3反應(yīng)呈陰性;1H NMR (400 MHz，C5D5N)δ :5.97(1H，m，H-3)，1.87 (3H，s，H-22)，1.06 (3H，s，H-18)，1.25 (3H，s，H-19);13C NMR (100 MHz，C5D5N)δ :81.0 (C-1)，199.0 (C-2)，124.6 (C-3)，164.2 (C-4)，44.1 (C-5)，26.9 (C-6)，74.2 (C-7)，47.2 (C-8)，49.3 (C-10)，80.4 (C-11)，81.6(C-12)，78.3 (C-13)，83.5 (C-14)，69.1 (C-15)，172.1 (C-16)，22.3 (C-17)，18.3 (C-18)，11.4 (C-19)，70.1 (C-20)。上述波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6，7］報(bào)道基本一致，確定為鴉膽苦素D。

鴉膽因H:白色結(jié)晶，mp:283～284 ℃;1H NMR(400 MHz，C5D5N)δ :1.07 (3H，s，H-18)，1.66，2.17 (2H，m，H-6)，1.93 (3H，s，H-19)，2.91 (1H，bd，J=13 Hz，H-5)，3.69，4.95 (2H，d，J=7.5 Hz，H-20)，3.71 (1H，d，J =6.5 Hz，H-12)，4.36 (1H，s，H-1)，4.38 (1H，d，J=6.4 Hz，H-11)，5.24 (1H，m，H-7)，5.88 (1H，m，H-15)，5.96 (1H，s，H-3);13C NMR (100 MHz，C5D5N)δ :83.6 (C-1)，199.0(C-2)，125.6 (C-3)，163.7 (C-4)，43.9 (C-5)，28.5 (C-6)，79.4 (C-7)，51.1 (C-8)，45.8 (C-9)，48.6 (C-10)，76.1 (C-11)，78.3 (C-12)，84.7 (C-13)，84.1 (C-14)，71.2 (C-15)，175.3 (C-16)，11.8 (C-18)，22.4 (C-19)，70.7 (C-20)，65.0 (C-22)。以上波譜數(shù)據(jù)與理化性質(zhì)文獻(xiàn)報(bào)道［7］的鴉膽因H 基本一致。

3 討論

隨著鴉膽苦素D、鴉膽苦醇與鴉膽因H 藥理作用研究的不斷深入，該類化合物及其對(duì)照品的需求量也日益增加。本試驗(yàn)采用制備型高效液相色譜法分離得到上述三個(gè)苦木內(nèi)酯單體，不僅能夠得到高純度的化合物單體，而且快速簡(jiǎn)便、操作方便、便于收集，純度均大于98%，可作為對(duì)照品使用。本文對(duì)鴉膽子中苦木內(nèi)酯類化合物進(jìn)行制備分離，為進(jìn)一步大量制備鴉膽子中其它重要活性苦木內(nèi)酯提供了思路，也為天然產(chǎn)物中分離高純度的化合物單體提供了參考。

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