七葉一枝花內(nèi)生真菌Penicillium sp. (No.4)聚酮類次級(jí)代謝產(chǎn)物研究

劉艷輝，楊 旋，李九玲，郭志勇 ，鄧張雙，涂 璇，陳劍鋒，鄒 坤

化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 天然產(chǎn)物研究與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 三峽大學(xué)，宜昌443002

聚酮類化合物是一類具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物，特別是眾多真菌和放線菌的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物。大多數(shù)的抗生素，部分抗腫瘤藥物及免疫抑制劑等都屬于聚酮類化合物如紅霉素，絲裂霉素等。由于該類化合物具有豐富的結(jié)構(gòu)和生物活性多樣性而成為天然產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)，如cladoacetal A，B［1］，massarigenin A-D［2］，berkeleyacetal A-C［3］，Maklamicin［4］，22-Epoxyberkeleydione，berkeleydione，Miniolutelide A［5］，Berkeleydione，Berkeleytrione［6］，Tenuipyrone［7］，Codinaeopsin［8］。從神農(nóng)架地區(qū)瀕危藥用植物內(nèi)生菌中尋找活性次級(jí)代謝產(chǎn)物過(guò)程中發(fā)現(xiàn)來(lái)自七葉一枝花葉片的內(nèi)生真菌Penicillium sp. 的粗提物對(duì)肝癌細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制活性，進(jìn)一步的發(fā)酵，萃取，分離，鑒定得到八個(gè)聚酮類化合物1，3，14-三甲氧基-6-甲基-9，10-蒽醌(1)，bostrycin (2)，isorhodoptilometrin (3)，physcioin (4)，emodin (5)，aloesol(6)，coniochaetone B (7)，2，5-dimethyl-7-hydroxychromone (8)，其中化合物1 為一新天然產(chǎn)物。本文報(bào)道了化合物1～8 的結(jié)構(gòu)鑒定及其體外抑制肝癌細(xì)胞的活性。

圖1 化合物1～8 的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structures of compounds 1-8

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

X-4 數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)儀(溫度未校正)(北京泰克儀器有限公司);Bruker 400 核磁共振波譜儀;Finnigin 電噴霧質(zhì)譜儀;Varian prostar 高效液相色譜儀;AL204 電子天(METTLWR TOL EDO);S23100紫外分光光度計(jì)(SCINCO);N21001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)郎儀器有限公司)等;柱色譜和薄層色譜用硅膠均為青島海洋化工廠產(chǎn)品，其它試劑均為分析純。

1.2 菌種

Penicillium sp.菌株是采自神農(nóng)架地區(qū)的瀕危藥用植物七葉一枝花的葉片，菌種保存在三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院天然產(chǎn)物研究利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，保存在4 ℃的PDA 的培養(yǎng)基中。

1.3 菌種發(fā)酵培養(yǎng)

采用固體發(fā)酵方式，500 mL 三角瓶?jī)?nèi)裝60 g 大米，120 mL 蒸餾水，經(jīng)121 ℃(0.1 MPa)高溫滅菌25 min 后在超凈工作臺(tái)上接種，共接種50 瓶，于室溫靜置培養(yǎng)40 d。

1.4 提取分離

真菌Penicillium sp. 在大米培養(yǎng)基上發(fā)酵完畢后，于三角瓶中搗碎培養(yǎng)基，加入適量乙酸乙酯，置于200 rpm 搖床上振搖12 h，重復(fù)提取三次，合并收集乙酸乙酯，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得浸膏15 g，浸膏經(jīng)200～300 目硅膠拌樣，上正相硅膠柱，用不同濃度的石油醚-乙酸乙酯，及乙酸乙酯-甲醇的梯度洗脫，收集各組分，經(jīng)TLC 分析合并，得到8 個(gè)不同的片段，片段4 和7 經(jīng)反復(fù)的硅膠柱層析，Sephadex LH-20，HPLC 制備等得到化合物1～8，其中1，3，14-三甲氧基-6-甲基-9，10-蒽醌(1)10 mg，bostrycin (2)30 mg，Isorhodoptilometrin (3)20 mg，physcioin (4)10 mg，大黃素(5)8 mg，aloesol (6)7 mg，coniochaetone B (7)10 mg，2，5-dimethyl-7-hydroxychromone(8)8 mg.

1.5 抗肝癌活性實(shí)驗(yàn)

用MTT 法檢測(cè)8 個(gè)化合物對(duì)Hep G2 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。從母液開(kāi)始，依次4 倍稀釋，共5 個(gè)梯度，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep G2 細(xì)胞分別接種于96 孔板，每孔100 μL (約1 ×104 個(gè)細(xì)胞/孔)，6 h 后加入25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78 μg/mL 不同濃度藥物100 μL，每一濃度3 個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后加入MTT 10 μL (質(zhì)量濃度為5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄上清，每孔加入二甲基亞砜100 μL 后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定492 nm 處吸光度OD 值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(實(shí)驗(yàn)組平均OD值/ 對(duì)照組平均OD 值)×100 %。

2 結(jié)果與討論

化合物1 為黃色無(wú)定型固體，其一維的氫譜和碳譜顯示出來(lái)的信息非常簡(jiǎn)單，其一維氫譜中顯示七組氫信號(hào)峰，其中位于δ 7.47 (s，1H)的氫信號(hào)顯示該化合物可能存在一個(gè)2，3，4，5，6-五取代苯環(huán)，位于δ 7.56 (d，2.0，1H)，7.23 (d，2.0，1H)的氫信號(hào)表明化合物1 中可能存在一個(gè)1，3，4，5-四取代苯環(huán)。其余氫信號(hào)均為處于高場(chǎng)的甲基和甲氧基信號(hào)分別位于δ 2.45 (s，3H)，3.89 (s，3H)，3.95(s，3H)，3.94 (s，3H)。其一維碳譜顯示出蒽醌類化合物的特征，包括位于δ 185.4 和183.8 的羰基信號(hào)，還 有位 于δ 161. 1，155. 2，149. 9，147. 0，136.8，136. 8，125. 3，122. 6，122. 2，120. 5，119. 4，106.4 芳香碳信號(hào)，位于δ 61.4，56.9，56.5，22.2 甲基信號(hào)，綜合分析上述一維NMR 圖譜發(fā)現(xiàn)該化合物為蒽醌類多羥基(甲氧基)取代的衍生物。HMBC 是不能確定其準(zhǔn)確取代位置。通過(guò)進(jìn)一步的NOESY 譜分析表明，H-4 與H-12 存在NOE 效應(yīng)，表明H-4 處于12 位甲氧基的鄰位，剩余的羥基與一個(gè)甲氧基的位置關(guān)系，因?yàn)闆](méi)有相應(yīng)的HMBC 與NOE相關(guān)而不能通過(guò)NMR 證據(jù)證實(shí)，經(jīng)與文獻(xiàn)比較發(fā)現(xiàn)［9］，當(dāng)1 位是甲氧基2 位是羥基時(shí)，其NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值相符，因而確定該部分的三個(gè)取代基之間的相對(duì)位置關(guān)系;在NOESY 中，同樣我們也觀察到H-5 與H-13，H-7 與H-13，H-7 與H-14 的相關(guān)關(guān)系存在，這就更加證明前面HMBC 的結(jié)果，即H-5，H-7，H-13 及H-14 的相互之間的位置關(guān)系。因此確定化合物為1，3，14-三甲氧基-6-甲基-9，10-蒽醌，通過(guò)文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)該化合物1 為一合成產(chǎn)物［10］，首次從天然界分離得到，為一新的天然產(chǎn)物。

圖2 化合物1 主要HMBC 和NOESY 相關(guān)關(guān)系ig.2 The key HMBC and NOESY correlations of compound 1

表1 化合物1 的NMR 數(shù)據(jù)Table 1 The NMR data of compound 1(1H，400 MHz，13C，100 MHz，CD3OD-d4)

化合物2 為淡黃色無(wú)定形粉末，熔點(diǎn)252～253 ℃，1H NMR(400 MHz，DMSO-d6):13.4 (s，1H)，12.6 (s，1H)，6.47 (s，1H)，5.26 (d，5.2，1H)，4.96 (d，4.4，1H)，4.74 (t，4.8，1H)，4.51(s，1H)，3.51 (t，4.4，1H)，2.69 (dd，8，18，2H);13C NMR (400 MHz，DMSO-d6):184.5，177.7，160.5，160.2，160.1，139.5，136.8，110.0，109.9，107.6，76.4，69.4，68.3，57.0，34.9，25.7。通過(guò)查閱文獻(xiàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)化合物2 與bostrycin 的波譜數(shù)據(jù)一致［11］，因而確定化合物2 為bostrycin。

化合物3 紅色固體，1H NMR(400 MHz，Acetone-d6):12.22 (s，1H)，12.17 (s，1H)，12.10 (s，1H)，7.66 (d，2.4，1H)，7.21 (d，1.6，1H)，7.26(d，2.4，1H)，6.66 (d，1.8，1H)，4.09 (m，1H)，2.85 (dd，5.0，12.8，2H)，1.22 (d，6.2，3H);13C NMR(100 MHz，Acetone-d6):191.6，182.3，166.9，166.3，166.0，151.3，136.6，134.0，125.6，122.0，114.8，110.2，109.9，108.8，68.2，46.4，23.8。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)化合物3 與Isorhodoptilometrin 的波普數(shù)據(jù)一致［12］，因而確定化合物3 為Isorhodoptilometrin。

化合物4 橙紅色固體，熔點(diǎn)202～203 ℃，1H(400 MHZ，Acetone-d6):12.31 (s，1H)，12.11 (s，1H)，7.63 (dd，1.5，0.5 Hz，1H)，7.37 (d，2.5 Hz，1H)，7.08 (dd，2.5，1.0 Hz，1H)，6.69 (d，2.5 Hz，1H)，3.94 (s，3H)，2.45 (s，3H);13C (100 MHZ，Acetone-d6):190.8 (C)，182.0 (C)，166.6 (C)，165.2(C)，162.5(C)，148.4(C)，135.3(C)，133.2(C)，124.5 (C)，121.3 (C)，113.7 (C)，110.3(CH)，108.2 (C)，106.8 (CH)，56.1 (CH3)，22.1(CH3)通過(guò)與文獻(xiàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)化合物4 與大黃素甲醚的波譜數(shù)據(jù)一致［13］，因而確定化合物4 為大黃素甲醚。

化合物5 橙紅色固體，1H (400 MHZ，Acetoned6):12.15 (1H，s)，12.03 (1H，s)，10.16(1H，s)，7.54 (1H，d，J = 1.2 Hz)，7.25(1H，d，2.4 Hz)，7.14(1H，d，0.6 Hz)，6.66(1H，d，2.4Hz)，2.45(3H，s);13C (100 MHZ，Acetone-d6):192.3，182.6，167.2，167.0，164.4，150.6，137.4，135.0，125.5，122.1，118.5，115.3，110.6，109.8，23.1;通過(guò)與文獻(xiàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)化合物5 與大黃素的波譜數(shù)據(jù)一致［13］，因而確定化合物5 為大黃素。

化合物6 無(wú)色晶體，熔點(diǎn)196～198 ℃，1H NMR(400 MHz，Acetone-d6):6.65(d，2.0，1H)，6.63 (br s，1H)，6.05 (s，1H)，4.19 (dd，5.6，6.2，1H)，2.72 (s，3H)，2.68 (m，2H)和1.27 (s，3H);13C NMR(100 MHz，Acetone-d6):182.0 (C)，167.0 (C)，163.8 (C)，161.6(C)，143.5(C)，118.4 (CH)，115.6 (C)，112.5 (CH)，101.8(CH)，66.4(CH)，44.2(CH2)，23.5(CH3)，23.1(CH3);通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)化合物6 與aloesol 的數(shù)據(jù)一致［14］，因而確定化合物6 為aloesol。

化合物7 白色晶體，熔點(diǎn)200～202 ℃;1H NMR(400 MHz，Acetone-d6):6.82 (s，1H)，6.61(s，1H)，5.27 (d，6.8，1H)，3.15 (q，7.6，16.2，1H)，2.86 (dd，3.6，9.2.1H)，2.45 (m，1H)，1.96(m，1H)2.43 (s，3H);通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)化合物7與coniochaetone B 的波譜數(shù)據(jù)一致［15］，因而確定化合物7 為coniochaetone B。

化合物8 無(wú)色晶體，熔點(diǎn)158～159 ℃，1H NMR (400 MHz，acetone-d6):6.64 (s，1H)，6.63(s，1H)，6.00(s，1H)，2.32(s，3H);13C NMR(100 MHz，acetone-d6):182.0 (C)，166.6 (C)，163.3(C)161.5 (C)，143.6 (C)，118.1 (CH)，115.5(C)，111.4 (CH)，101.7 (CH)，19.8 (CH3)。通過(guò)查閱文獻(xiàn)［16］，該化合物與2，5-dimethyl-7-hydroxychromone 的波普數(shù)據(jù)一致，因確定化合物8 為2，5-dimethyl-7-hydroxychromone。

化合物1～8 采用MTT 方法評(píng)價(jià)其體外抑制肝癌細(xì)胞活性，結(jié)果顯示化合物1，3，14-三甲氧基-6-甲基-9，10-蒽醌(1)，bostrycin (2)和isorhodoptilometrin (3)對(duì)肝癌細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制活性，其IC50分別為15.6，5.8，13.2 μg/mL 化合物，而化合物4～8 的IC50值均大于50 μg/mL。

從瀕危藥用植物七葉一枝花內(nèi)生真菌Penicillium sp. (NO.4)中分離得到八個(gè)化合物，經(jīng)核磁共振，質(zhì)譜等手段鑒定其結(jié)構(gòu)分別為1，3，14-三甲氧基-6-甲基-9，10-蒽醌(1)，bostrycin (2)，isorhodoptilometrin (3)，physcioin (4)，emodin (5)，aloesol(6)，coniochaetone B (7)，2，5-dimethyl-7-hydroxychromone (8)，其中化合物1 為一新天然產(chǎn)物。體外細(xì)胞毒活性顯示化合物1，3，14-三甲氧基-6-甲基-9，10-蒽醌(1)，bostrycin (2)和isorhodoptilometrin(3)對(duì)肝癌細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制活性，其IC50分別為15.6，6.5，13.2 μg/mL。本文研究結(jié)果表明內(nèi)生菌具有產(chǎn)生各種活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力，同時(shí)為那些瀕危藥用植物的保護(hù)與開(kāi)發(fā)提供了新的途徑。

1 Holler U，Gloer JB，Wicklow DT. Biologically active polyketide metabolites from an undetermined fungicolous hyphomycete resembling Cladosporium. J Nat Prod，2002，65:876-882.

2 Oh H，Swenson DC，Gloer JB，et al. New bioactive rosigenin analogues and aromatic polyketide metabolites from the freshwater aquatic fungus Massarina tunicate. J Nat Prod，2003，66:73-79.

3 Stierle DB，Stierle AA，Patacini B.The berkeleyacetals，three meroterpenes from a deep water acid mine waste Penicillium.J Nat Prod，2007，70:1820-1823.

4 Igarashi Y，Ogura H，F(xiàn)urihata K，et al. Maklamicin，an antibacterial polyketide from an endophytic Micromonospora sp.J Nat Prod，2011，74:670-674.

5 Iida M，Ooi T，Kito K，et al.Three new polyketide-terpenoid hybrids from Penicillium sp..Org Lett，2008，10:845-848.

6 Stierle DB，Stierle AA，Hobbs JD，et al. Berkeleydione and berkeleytrione，new bioactive metabolites from an acid mine organism.Org Lett，2004，6:1049-1052.

7 Asai T，Chung YM，Sakurai H，et al. Tenuipyrone，a novel skeletal polyketide from the entomopathogenic fungus，Isaria tenuipes，cultivated in the presence of epigenetic modifiers.Org Lett，2012，14:513-515.

8 Kontnik R，Clardy J. Codinaeopsin，an antimalarial fungal polyketide.Org Lett，2008，10:4149-4151.

9 El-Gamal AA，Takeya K，Itokawa H，et al. Anthraquinones from galium sinaicum.Phytochemistry，1995，40:245-251.

10 Roberge G，Brassard P.Reactions of ketene acetals.13.Synthesis of contiguously trihydroxylated Naphtho-and Anthraquinones.J Org Chem，1981，46:4161-4166.

11 Chen H，Zhong L，Long Y，et al.Studies on the synthesis of derivatives of marine-derived bostrycin and their structureactivity relationship against tumor cells. Mar Drugs，2012，10:932-952.

12 Khamthong N，Rukachaisirikul V，Tadpetch K，et al. Tetrahydroanthraquinone and xanthone derivatives from the marine-derived fungus Trichoderma aureoviride PSU-F95. Archives of Pharmacal Research，2012，35:461-468.

13 Li XL(李新蘭)，Xu Y(徐穎)，Pan DR(潘冬瑞)，et al.Five anticancer anthraquinone derivates from mangrove endophytic fungus Paecilomyces sp. (tree1-7). J of China Three Gorges Univ.Nat Sci(三峽大學(xué)學(xué)報(bào)，自科版)，2010，32:101-105.

14 Kashiwada Y，Nonaka GI，Nishioka I. Chromone glucosides from rhubarb.phytochemistry，2009，29:1007-1009.

15 Wang H，Gloer JB，Scott JA，et al.Coniochaetones A and B:new antifungal benzopyranones from the coprophilous fungus Coniochaeta saccardoi. Tetrahydron Letter，1995，36:5847-5850.

16 Kametani S，Yuasa AK，Kikuzaki H，et al.Chemical constituents of Cape Aloe and their synergistic growth inhibiting effect on Ehrlich Ascites Tumor cells.Biosci Biotechnol Biochem，2007，71:1220-1229.