土壤中昆蟲病原線蟲種群密度檢測(cè)新方法

戰(zhàn)麗莉，王 義，許艷麗，裴希超，劉振宇

(1. 中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所中國(guó)科學(xué)院黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海倫農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外觀測(cè)研究站，黑龍江哈爾濱150081; 2. 黑河學(xué)院物理化學(xué)系，黑龍江黑河164300; 3.Rutgers University，New Brunswick NJ 08901－8520，USA; 4. 黑河出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江黑河164300;5. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱150086)

0 引 言

昆蟲病原線蟲(Entomapathgenic Nematoda)是一類專性寄生土壤害蟲的微小動(dòng)物，屬動(dòng)物界、線蟲門(Nematoda)、側(cè)尾腺口綱(Secernentea)、圓線蟲目(Rhabditida)，斯氏線蟲科(Steinernematidae)和異小桿線蟲科(Heterhabditidae)。昆蟲病原線蟲由于具備對(duì)害蟲致死范圍廣、致死速度快、對(duì)人畜以及其它有益生物包括害蟲天敵等無(wú)不良影響、對(duì)環(huán)境無(wú)污染以及易于規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，成為害蟲生物防治的重要因子，被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用。昆蟲病原線蟲主要生活在土壤中，具有主動(dòng)搜尋昆蟲寄主的能力［1］。昆蟲病原線蟲可有效地控制鉆蛀性害蟲，對(duì)花生田地下害蟲蠐螬防效可達(dá)到95%以上，效果明顯好于辛硫磷的防治效果［2］，試驗(yàn)對(duì)大豆田地下害蟲東北大黑鰓金龜(Holotrichia oblita)的幼蟲進(jìn)行防治，發(fā)現(xiàn)致死率同樣達(dá)到95%以上［3］。但紫外光、部分病原微生物和捕食性天敵對(duì)昆蟲病原線蟲有抑制作用［4－6］，因此施用后昆蟲病原線蟲在土壤中的種群數(shù)量會(huì)隨時(shí)間推移發(fā)生變化，進(jìn)而影響昆蟲病原線蟲對(duì)害蟲的防治效果。生產(chǎn)中線蟲施用后在田間的密度、施用線蟲地塊存活數(shù)量等，對(duì)于評(píng)價(jià)線蟲應(yīng)用效果和線蟲在土壤中定殖很重要，因此，對(duì)施入昆蟲病原線蟲的田塊進(jìn)行昆蟲病原線蟲密度檢測(cè)是確保昆蟲病原線蟲防治害蟲效果的重要手段，也是確定是否需要再次施入昆蟲病原線蟲的重要依據(jù)，同樣也是研究過程中的追蹤調(diào)查重要手段。而土壤中線蟲種類繁多、數(shù)量巨大［7－8］，昆蟲病原線蟲僅為土壤線蟲的一種類群［9］，前人對(duì)昆蟲病原線蟲定性和定量的監(jiān)測(cè)方法有懸浮離心法［10］和誘集法［11］，懸浮離心法要將土壤樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行相應(yīng)的處理后進(jìn)行一次離心和兩次懸浮離心。誘集法同樣要將土壤樣品帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行誘集，誘集過程中需人工翻動(dòng)誘集裝置數(shù)次已達(dá)到最佳的誘集效果。這兩種方法需進(jìn)行田間取樣，該過程會(huì)破壞農(nóng)作物，另外在定量監(jiān)測(cè)時(shí)采用大蠟螟誘集直至土樣中沒有線蟲為止要花費(fèi)很多時(shí)間，同時(shí)還要對(duì)被侵染的大蠟螟逐頭解剖計(jì)數(shù)線蟲，此過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。所以，準(zhǔn)確、快速地確定檢測(cè)土壤中昆蟲病原線蟲的密度是試驗(yàn)研究和線蟲應(yīng)用及技術(shù)指導(dǎo)中急需解決的問題，研究報(bào)道了土壤中昆蟲病原線蟲密度定量檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)可方便、快捷、準(zhǔn)確地檢測(cè)土壤中昆蟲病原線蟲密度，并可有效地促進(jìn)昆蟲病原線蟲試驗(yàn)研究和應(yīng)用，為研究結(jié)果的實(shí)施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

昆蟲病原線蟲(Heterorhabditis bacteriophora)侵染期線蟲(Infective Juveniles，IJ)由中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所農(nóng)田有害生物控制實(shí)驗(yàn)室保存，試驗(yàn)用的大蠟螟(Galleria mellonella)屬鱗翅目螟蛾科蠟螟亞科，其幼蟲是昆蟲病原線蟲重要寄主之一，由于大蠟螟幼蟲對(duì)昆蟲病原線蟲極為敏感的特點(diǎn)，人們常采用大蠟螟進(jìn)行昆蟲病原線蟲分離、誘集、繁殖和對(duì)昆蟲致病力測(cè)定［12］。研究用大蠟螟末齡幼蟲(Galleria mellonella)購(gòu)于天津惠裕德生物科技有限公司，昆蟲病原線蟲種群密度檢測(cè)器為自制，并獲得授權(quán)專利(ZL201010205217.8)。試驗(yàn)用滅菌土取自本所試驗(yàn)田耕層黑土，160 ℃下烘干2 h 滅菌備用。生物顯微鏡(Motic s633069)下昆蟲病原線蟲計(jì)數(shù)，試驗(yàn)用長(zhǎng)方形塑料盒為32 cm × 23 cm × 15 cm。

1.2 方法

利用昆蟲病原線蟲依賴寄主昆蟲繁殖并具有趨化性的特點(diǎn)，采用室內(nèi)模擬試驗(yàn)方法，優(yōu)化昆蟲病原線蟲對(duì)寄主昆蟲大蠟螟的趨向時(shí)間，即昆蟲病原線蟲種群密度檢測(cè)器的使用時(shí)間的確定，同時(shí)優(yōu)化監(jiān)測(cè)器之間的距離，確定最佳收集距離。利用昆蟲病原線蟲昆蟲種群密度檢測(cè)器檢測(cè)土壤中昆蟲病原線蟲種群密度。

1.2.1 昆蟲病原線蟲收集時(shí)間優(yōu)化。將4.5 kg 滅菌土裝入長(zhǎng)方形塑料盆中，加入511 ml 無(wú)菌水和102 ml的線蟲懸浮液，使土壤濕度保持在12%。侵染期線蟲(Infective Juveniles，IJ)按60 萬(wàn)IJ s·m－2接種線蟲，將昆蟲病原線蟲種群密度檢測(cè)器垂直插入塑料盒中。試驗(yàn)設(shè)接種線蟲后24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 5 個(gè)時(shí)間調(diào)查密度檢測(cè)器內(nèi)誘集到的線蟲數(shù)量。收集進(jìn)入到昆蟲病原線蟲種群密度檢測(cè)器中的線蟲懸浮液，顯微鏡下計(jì)數(shù)，每處理重復(fù)4 次，檢測(cè)器間距為8 cm。

1.2.2 昆蟲病原線蟲密度檢測(cè)器放置間距優(yōu)化。試驗(yàn)用塑料盒設(shè)置同上，檢測(cè)器放置之間的距離(兩相鄰管管心連線距離)為2 cm 、4 cm 、6 cm 、8 cm 和10 cm，48 h 收集，然后分別收集進(jìn)入到昆蟲病原線蟲種群密度檢測(cè)器中的線蟲懸浮液，顯微鏡下計(jì)數(shù)，每處理重復(fù)4 次。

1.2.3 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。優(yōu)化收集時(shí)間及檢測(cè)器間距后，在土壤中分別按10 萬(wàn)IJ s·m－2，20 萬(wàn)IJ s·m－2，40 萬(wàn)IJ s·m－2，60 萬(wàn)IJ s·m－2，80 萬(wàn)IJ s·m－2，100 萬(wàn)IJ s·m－2七個(gè)密度施入昆蟲病原線蟲的侵染期線蟲，48 h 后收集檢測(cè)器中管中收集到的昆蟲病原線蟲，并計(jì)數(shù)，依據(jù)管中昆蟲病原線蟲的數(shù)量和施入線蟲的密度建立曲線，3 次重復(fù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立分別在2010 年1 月7 日、3 月18 日和4 月14 日進(jìn)行試驗(yàn)重復(fù)，并依據(jù)3 次試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行最終標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)基本處理，采用DPS v3.01 軟件完成數(shù)據(jù)處理。利用one－way ANOVA 單因素方差分析多重比較(LSD)方法對(duì)不同處理數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，差異顯著水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆蟲病原線蟲收集時(shí)間優(yōu)化

利用昆蟲病原線蟲對(duì)寄主大蠟螟的趨向性進(jìn)行線蟲密度檢測(cè)，檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)昆蟲病原線蟲種群密度檢測(cè)器收集時(shí)間的長(zhǎng)短顯著影響檢測(cè)器中收集到的昆蟲病原線蟲的數(shù)量。在24 h 時(shí)昆蟲病原線蟲種群密度檢測(cè)器就有線蟲出現(xiàn)，線蟲條數(shù)為27 條，見圖1。在24 h 到120 h 區(qū)間線蟲在密度檢測(cè)器中的數(shù)量出現(xiàn)了兩次高峰，即測(cè)定時(shí)間為48 h 與72 h 密度檢測(cè)器中線蟲條數(shù)分別為126 條和129 條，且48 h 與72 h兩測(cè)定時(shí)間之間檢測(cè)器收集到昆蟲病原線蟲數(shù)量差異較小，但與其他測(cè)定時(shí)間之間差異顯著(p ＞0.05)，72 h 后密度檢測(cè)器中線蟲數(shù)量開始緩慢下降，直至96 h 之后密度檢測(cè)器中線蟲數(shù)量基本處于平穩(wěn)階段。分析原因可能是昆蟲病原線蟲需要一定的活動(dòng)空間，且在檢測(cè)器中昆蟲病原線蟲的數(shù)量達(dá)到一定程度即昆蟲病原線蟲在收集管中的密度達(dá)到一定的臨界值時(shí)，因空間、氧氣等外界條件的限致使昆蟲病原線蟲爬出，導(dǎo)致檢測(cè)器中昆蟲病原線蟲數(shù)量降低。48 h 和72 h 兩個(gè)收集時(shí)間之間昆蟲病原線蟲種群密度檢測(cè)器中昆蟲病原線蟲數(shù)量差異不顯著(p ＞0.05)，從節(jié)省時(shí)間以及試驗(yàn)的準(zhǔn)確度上考慮，48 h 為昆蟲病原線蟲密度檢測(cè)器的最佳收集時(shí)間。

圖1 不同收集時(shí)間EPN 對(duì)大蠟螟趨性影響Fig.1 Effects of different collection time on the trend from EPN to Galleria mellonella

2.2 昆蟲病原線蟲密度檢測(cè)器間距優(yōu)化

預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，病原線蟲種群密度檢測(cè)器對(duì)昆蟲病原線蟲的檢測(cè)效率受檢測(cè)器之間距離影響，因此，研究對(duì)昆蟲病原線蟲種群密度檢測(cè)器施用間距進(jìn)行了優(yōu)化。在檢測(cè)器間距為8 cm 時(shí)昆蟲病原線蟲種群密度檢測(cè)器的收集數(shù)目達(dá)到最大，達(dá)18 條/管，顯著高于間距為2 cm、4 cm、6 cm 和10 cm 時(shí)昆蟲病原線蟲種群密度檢測(cè)器的收集數(shù)目，與其他4 個(gè)距離差異顯著，見圖2。當(dāng)收集管之間的距離過近時(shí)昆蟲病原線蟲在一定范圍內(nèi)土壤中的數(shù)量有限，因此昆蟲在每個(gè)檢測(cè)器中收集到的數(shù)量較低。當(dāng)檢測(cè)器之間的距離過大時(shí)，寄主釋放的信息物質(zhì)濃度低于檢測(cè)器間距小的情況。綜合土壤中昆蟲病原線蟲的數(shù)量和寄主昆蟲釋放出的信息物質(zhì)的濃度兩種因素，認(rèn)為昆蟲病原線蟲種群密度檢測(cè)器的最佳使用間距為8 cm。

圖2 不同距離EPN 對(duì)大蠟螟趨性Fig.2 Effect of distance between collection tubes on the trend from EPN to Galleria mellonella

2.3 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。昆蟲病原線蟲檢測(cè)器中收集到昆蟲病原線蟲的數(shù)量與盒外土壤中昆蟲病原線蟲的密度具有顯著的相關(guān)性，因此通過3 次室內(nèi)模擬試驗(yàn)建立昆蟲病原線蟲種群密度檢測(cè)器中收集到的線蟲數(shù)量和土壤中昆蟲病原線蟲密度的關(guān)系曲線，見圖3。在標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的3 次重復(fù)試驗(yàn)中，第一次和第三次結(jié)果表明土壤中昆蟲病原線蟲的密度和檢測(cè)器中收集到的昆蟲病原線蟲的條數(shù)顯著相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)R2分別為0.902 4 和0.936 4。但在第二次標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的重復(fù)試驗(yàn)中二者之間的相關(guān)系數(shù)R2僅為0.707 2，分析其中的原因可能為在進(jìn)行第二次室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)時(shí)室內(nèi)溫度較低，前兩次重復(fù)實(shí)驗(yàn)在正常室溫下進(jìn)行，室溫范圍在17 ℃～20 ℃之間，而第三次試驗(yàn)因天氣原因，室內(nèi)氣溫低于16 ℃，致使昆蟲病原線蟲的活動(dòng)較緩慢。

2.3.2 最終標(biāo)準(zhǔn)曲線建立。綜合3 次試驗(yàn)結(jié)果，建立最終大蠟螟對(duì)昆蟲病原線蟲趨性標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。昆蟲病原線蟲檢測(cè)器中收集到的昆蟲病原線蟲與土壤中昆蟲病原線蟲的密度顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.929 5。

4 討 論

在利用昆蟲病原線蟲控制害蟲時(shí)，研究者或植物保護(hù)工作者將昆蟲病原線蟲釋放到田間進(jìn)行害蟲防治后，需要跟蹤監(jiān)測(cè)線蟲在土壤中的存活情況以便決定下一次應(yīng)用的必要性、應(yīng)用時(shí)間及用量。研究方法在進(jìn)行定性及定量試驗(yàn)時(shí)無(wú)需將土壤取回且不破壞田間作物，較前人研究的方法更快速簡(jiǎn)便。昆蟲病原線蟲的活動(dòng)能力和侵染能力受到很多外界的影響，在外界環(huán)境因素出現(xiàn)變化的時(shí)候標(biāo)準(zhǔn)曲線也要重新建立，是否可以建立一個(gè)具有普遍適用性的標(biāo)準(zhǔn)曲線以減少實(shí)際操作時(shí)的步驟，是此方法有待改進(jìn)之處。目前為止該技術(shù)在田間應(yīng)用時(shí)應(yīng)根據(jù)不同條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行適當(dāng)校正和調(diào)整后再進(jìn)行田間應(yīng)用。研究收集時(shí)間是在節(jié)省時(shí)間的前提下選定的，而在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求的不同對(duì)收集時(shí)間進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，若以收集昆蟲病原線蟲為目的則應(yīng)重新確定收集到昆蟲病原線蟲數(shù)量最多的時(shí)間，已達(dá)到收集量最大的目的。此方法只針對(duì)一種昆蟲病原線蟲進(jìn)行試驗(yàn)，是否對(duì)其他品系的昆蟲病原線蟲有效還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定。

圖3 EPN 對(duì)大蠟螟趨性標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of the trend from EPN to Galleria mellonella

圖4 EPN 對(duì)大蠟螟趨性標(biāo)準(zhǔn)曲線(最終)Fig.4 Standard curve of the trend from EPN to Galleria mellonella (Final)

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