不穩(wěn)定性心絞痛患者冠狀動脈病變程度與外周血內(nèi)皮祖細胞及高敏C反應蛋白的關系

涂 昌 陳杰民 李淑芬 梁逸仙 蘭 軍 陳本發(fā) 潘偉彪

南方醫(yī)科大學附屬東莞市石龍人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東東莞 523326

外周血管內(nèi)皮祖細胞 （endothelial progenitor cells，EPCs） 是外周循環(huán)血中能夠分化為血管內(nèi)皮細胞（ECs）的前體細胞，這首先于1997 年由Asahara 等[1]初次發(fā)現(xiàn)，EPCs 對于血管損傷的修復及維護血管內(nèi)皮的完整性的研究仍是一個重要的方向。目前已經(jīng)確定內(nèi)皮祖細胞可以促進各類微血管新生，修復損傷的血管內(nèi)皮及維持內(nèi)皮功能的完整性。 但是EPCs 的鑒定存在有不同的爭議， 然而檢測外周血CD34 及CD133 雙陽性細胞是公認鑒定EPCs 的一個主要手段[2-3]。有研究表明，穩(wěn)定性心絞痛患者的外周血EPCs同正常人相比較明顯降低，但急性期的急性心肌梗死患者EPCs 反而較正常人增加[4]，這可能與急性心肌梗死患者內(nèi)皮嚴重受損而激活EPCs 有關，然而不穩(wěn)定性心絞痛患者外周血EPCs 的水平及是否同冠狀動脈病變狹窄程度是否有一定的關系目前尚無相關研究，另外不穩(wěn)定性心絞痛患者內(nèi)皮損傷后炎性反應是否同EPCs 數(shù)量是否相關亦無相關研究，本研究擬通過不穩(wěn)定性心絞痛患者冠狀動脈病變程度與外周血EPCs 的數(shù)量及高敏C 反應蛋白（hs-CRP）水平的相關性，探討不穩(wěn)定性心絞痛患者中冠狀動脈病變對外周血EPCs 數(shù)量及hs-CRP 水平的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010 年12 月～2013 年6 月在南方醫(yī)科大學附屬東莞市石龍人民醫(yī)院心血管內(nèi)科住院治療的不穩(wěn)定性心絞痛患者55 例為實驗組，年齡45～69 歲，不穩(wěn)定心絞痛患者的診斷符合第7 版《內(nèi)科學》教材上面制定的標準，即新發(fā)的心絞痛或者穩(wěn)定性心絞痛在近1 個月內(nèi)加重的患者， 發(fā)作時的心電圖有ST 段的改變，而心酶及肌鈣蛋白沒有升高。 同時在住院或門診患者中選擇無冠狀動脈狹窄患者30 例為對照組，兩組患者均排除有嚴重肝腎功能不全、糖尿病、惡性腫瘤及其他心腦血管疾病等各種影響檢測因素的疾病，所有患者檢測時均未服用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）及血管緊張素受體拮抗劑（ARB）類降壓藥及抗凝和調(diào)脂藥。

1.2 方法

1.2.1 實驗組與對照組均在入院后空腹抽取靜脈血5 mL。測定采用全自動生化分析儀測定血總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及三酰甘油（TG），在貝克曼免疫分析儀中測試hs-CRP。

1.2.2 采用流式細胞儀測定外周血EPCs 數(shù)量。實驗組及對照組患者在行冠脈造影或者冠狀動脈CT 檢查之前即使用乙二胺四乙酸（EDTA）管抽取2 mL 靜脈血，采用流式細胞儀（美國BECKMAN.COULTER 公司） 測定外周血CD34 及CD133 雙陽性細胞的含量，CD133 流式細胞熒光抗體的一抗及二抗分別在Neomarker 公司及Southern Biotech 公司中購取，而CD34流式細胞熒光抗體在BD 公司中購取。 實驗時采取患者200 μL 外周血先后同CD133 的流式細胞熒光抗體一抗及二抗各孵育20 min 后加入CD34 的流式細胞熒光抗體再孵育20 min。將紅細胞溶解后剩余的細胞用20 g/L 多聚甲醛固定，然后采用流式細胞儀檢測CD34 及CD133 雙陽性細胞。 最后計算10 萬個單個核細胞中CD34 及CD133 雙陽性細胞數(shù)量。

1.2.3 評估冠狀動脈血管狹窄程度。 本研究采用兩種方式評估冠狀動脈的狹窄程度，即冠狀動脈造影及冠狀動脈CT 檢查，使用32 排CT 在使用造影劑后行冠狀動脈血管掃描重組，如果冠狀動脈正常則不再進行冠狀動脈造影檢查，而冠狀動脈有病變患者再行冠狀動脈造影檢查以進一步評估血管狹窄程度，冠狀動脈造影常規(guī)使用Judkin 技術，經(jīng)橈動脈或者股動脈穿刺后放入造影導管進行冠狀動脈造影檢查， 然后再由2 位以上經(jīng)驗豐富的醫(yī)師據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果圖片來綜合評估冠狀動脈病變部位的性質(zhì)及狹窄程度。冠狀動脈病變狹窄程度根據(jù)冠狀動脈病變Gensini 的總積分確定。 Gensini 積分根據(jù)美國心臟病協(xié)會的最新標準，定量這段病變的冠狀動脈狹窄程度。 計分標準為狹窄程度≤25%計1 分，＞25%～50%計2 分，＞50%～75%計4 分，＞75%～90%計8 分，＞90%～99%計16 分，＞99%～100%計32 分。 最后根據(jù)冠狀動脈病變的節(jié)段乘以相應系數(shù)：左冠狀動脈主干乘以5，左前降支近段及左回旋支乘以2.5，中段乘以1.5，左前降支遠段、第一對角支、左回旋支遠段、后降支、鈍緣支及右冠狀動脈近、中、遠段和后降支均乘以1，第二對角支及右冠脈后側(cè)支乘以0.5；計算狹窄程度的總積分，即為各節(jié)段積分之和。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0 對數(shù)據(jù)進行分析， 正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（s）表示，兩獨立樣本的計量資料采用t 檢驗。 多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，相關性分析使用單因素直線相關分析法。 以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

不穩(wěn)定性心絞痛實驗組及對照組兩組年齡、性別、吸煙比例、血壓及體重指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），不穩(wěn)定性心絞痛實驗組TC 及LDL-C高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。 見表1。

表1 兩組患者一般資料比較（s）

表1 兩組患者一般資料比較（s）

注：同對照組比較，*P ＜0.05；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；BMI：體重指數(shù)；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；1 mm Hg=0.133 kPa

實驗組對照組55 30 59.49±6.97 58.93±7.25吸煙比例（%）55 51 SBP（mm Hg）145.26±23.15 142.85±18.38 DBP（mm Hg）76.23±14.54 78.16±12.02 BMI（kg/m2）23.95±3.24 23.58±4.13 TC（mmol/L）6.08±0.47*4.97±0.81 TG（mmol/L）2.05±1.53 1.95±1.38 HDL-C（mmol/L）1.12±0.35 1.14±0.28 LDL-C（mmol/L）3.22±0.79*2.76±0.55

2.2 兩組患者EPCs 及hs-CRP 比較

與對照組比較，實驗組患者EPCs 數(shù)量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），而hs-CRP 實驗組明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。 見表2。

表2 兩組患者EPCs 及hs-CRP 比較（s）

表2 兩組患者EPCs 及hs-CRP 比較（s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05；EPCs：外周血內(nèi)皮祖細胞；hs-CRP：高敏C 反應蛋白

EPCs（個/10 萬） hs-CRP（μmol/L）實驗組對照組55 30 30.95±5.50*58.66±4.45 40.25±9.80*3.45±1.68

2.3 實驗組內(nèi)不同Gensini 患者EPCs 數(shù)量比較

實驗組中，EPCs 數(shù)量隨著冠狀動脈狹窄程度Gensini 評分的增加亦隨之升高（P ＜0.05）；冠狀動脈Gensini 評分與EPCs 即CD34 及CD133 雙陽性細胞的數(shù)量呈正相關 （r = 0.593，P ＜0.01）， 而冠狀動脈Gensini 評分與hs-CRP 不具有相關性（r = 0.114，P ＞0.05）。 見表3。

表3 不同Gensini 評分患者EPCs 數(shù)量比較（s）

表3 不同Gensini 評分患者EPCs 數(shù)量比較（s）

注：與0～15 分比較，*P ＜0.05；與＞15～30 分比較，#P ＜0.05；EPCs：外周血內(nèi)皮祖細胞；hs-CRP：高敏C 反應蛋白

0～15 分＞15～30 分＞30 分18 20 17 27.92±4.12 32.15±5.25*37.05±4.96#41.33±10.25 39.38±9.56 42.26±8.95

3 討論

不穩(wěn)定性心絞痛目前是心血管疾病中最常見的一種類型，也是導致心血管事件的主要因素之一。 引起不穩(wěn)定性心絞痛的病因仍在于冠狀動脈內(nèi)皮功能不全，導致冠脈內(nèi)不穩(wěn)定粥樣斑塊的形成，斑塊內(nèi)出血或者斑塊纖維帽出現(xiàn)裂隙而引起血小板聚集及刺激冠狀動脈痙攣而引起心肌缺血的癥狀，所以目前來說， 冠脈內(nèi)皮功能不全仍是導致冠脈病變的起始因素。影響內(nèi)皮功能不全的因素多種多樣，如高血壓、糖尿病、吸煙、高脂血癥及應激等因素均會導致內(nèi)皮功能的損傷， 內(nèi)皮功能的損傷會引起一系列炎性反應，從而導致內(nèi)皮功能不全加重，當內(nèi)皮功能自我損傷修復機制不足以完善內(nèi)皮功能的情況下就會導致動脈粥樣斑塊的形成。目前對于血管內(nèi)皮功能的修復仍是目前研究的主要方向， 而EPCs 的發(fā)現(xiàn)是為冠脈內(nèi)皮的修復提供了一個新的研究方向。 國外學者在1999年發(fā)現(xiàn)EPCs 能夠維持動脈血管內(nèi)皮功能的穩(wěn)定和形成新生血管， 內(nèi)皮功能不全時能夠刺激外周血EPCs數(shù)量的增加， 所以外周血EPCs 的水平在一定程度上能夠反映冠脈內(nèi)皮化的程度。另外，EPCs 能夠促進血管新生及修復損傷的內(nèi)膜，對于冠心病的防治能夠起到重大的作用[5]。 相關研究也證實心肌組織等在缺血缺氧的情況下能夠誘使內(nèi)皮祖細胞從骨髓中的動員，導致外周血液循環(huán)內(nèi)皮祖數(shù)量的增加，從而引起新生血管的形成及修復損傷的血管內(nèi)皮，是機體對心肌缺血及內(nèi)皮損傷的一種代償反應[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)， 不穩(wěn)定性心絞痛患者中， 外周血EPCs 數(shù)量明顯低于對照組，而hs-CRP 數(shù)量明顯高于對照組，說明在不穩(wěn)定性心絞痛患者中由于存在有冠狀動脈粥硬化的多項因素而導致EPCs 數(shù)量的減少，而hs-CRP 的升高說明血管損傷后導致的炎性反應亦可能會導致EPCs 數(shù)量的減少[7]。 目前相關研究亦指出EPCs 能夠修復損傷的血管內(nèi)皮，而在冠狀動脈狹窄病變的患者中由于嚴重的內(nèi)皮損傷及內(nèi)皮功能障礙而引起EPCs 的過量消耗[8]。

另外，在本研究中發(fā)現(xiàn)在實驗組中由于冠狀動脈狹窄嚴重程度的不斷增加， 其外周血中EPCs 數(shù)量不斷升高。 如前所述，冠狀動脈斑樣斑塊的形成及引起冠狀動脈的狹窄主要起始因素在于冠脈內(nèi)皮功能不全，而隨著內(nèi)皮功能不全的加重，會進一步加重冠狀動脈的狹窄，在此研究中，冠脈狹窄程度的增加，其外周血EPCs 數(shù)量亦隨之增加， 這說明冠狀動脈缺血能夠刺激外周血EPCs 的增加來改善嚴重的血管內(nèi)皮功能不全及形成新生血管從而豐富側(cè)支循環(huán)，最后能夠維持缺血器官具有足夠的血液灌注[9-11]，而在本研究中發(fā)現(xiàn)，hs-CRP 的水平?jīng)]有隨著冠狀動脈狹窄程度的加重而進一步增高，考慮hs-CRP 升高主要在于血管內(nèi)皮損傷后炎癥反應所致，同斑塊的不穩(wěn)定程度相關，而不在于冠狀動脈的狹窄程度，這說明EPCs 隨著冠脈狹窄程度有加重，但這不單純由于血管內(nèi)皮損傷的炎癥反應導致EPCs 水平的升高， 可能還有其他相關的因素，這有待于以后研究中進一步完善。

綜上所述，冠心病不穩(wěn)定性心絞痛患者冠狀動脈狹窄程度主要在于血管內(nèi)皮功能障礙引起的，而內(nèi)皮功能障礙由多方面因素引起， 其中炎性反應如hs-CRP是影響內(nèi)皮功能的主要因素，內(nèi)皮功能損傷后啟動機體自身的修復系統(tǒng)以改善內(nèi)皮功能不全， 而外周血EPCs刺激增加可能維持心血管系統(tǒng)內(nèi)皮功能的穩(wěn)定，通過動員EPCs 的增加，能夠促進血管內(nèi)皮功能的改善及側(cè)枝循環(huán)的形成，從而有助于改善冠心病患者的癥狀，如果存在合適的因素動員EPCs 的增加，在防治冠心病不穩(wěn)定性心絞痛方面將起到一個非常重要的作用。

[1] Asahara T，Murohara T，Suilivan A，et al. Isolation of putative progcnitor endothelial cells for angiogenesis [J]. Science，1997，275（5302）：964-967.

[2] Hill JM，Zalos G，Halcox JPJ，et al. Circulating endothelial progenitor cells，vascular function，and cardiovascular risk [J].N Engl J Med，2003，348（7）：593-600.

[3] 王明勇，李燕，宋淑敏，等.人臍血內(nèi)皮祖細胞的體外培養(yǎng)[J].中國醫(yī)藥導報，2012，9（13）：32-34.

[4] Shintani S，Murohara T，Ikeda H，et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction [J]. Circulation，2001，103（23）：2776-2779.

[5] Takahashi T，Kalka C，Masuda H，et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelia progenitor cells for neovascularization [J]. Nature Med，1999，5（4）：434-438.

[6] Sieveking DP，Buckle A，Celermajer DS，et al. Strikingly different angiogenic properties of endothelial progenitor cell subpopulations：insights from a novel human angiogenesis assay[J].J Am Coll Cardiol，2008，51（6）：660-668.

[7] Cesari F，Marcucci R，Gori AM，et al. Impact of a cardiac rehabilitation program and inflammatory state on endothelial progenitor cells in acute coronary syndrome patients [J]. Int J Cardiol，2012，167（5）：22-29.

[8] Liu Y，Wei J，Chang M，et al. Proteomic analysis of endothelial progenitor cells exposed to oxidative stress [J]. Int J Mol Med，2013，32（3）：607-614.

[9] Yin L，Ohanyan V，Pung YF，et al. Induction of vascular progenitor cells from endothelial cells stimulates coronary collateral growth [J]. Circulation Research，2012，110（2）：241-252.

[10] Templin C，Luscher TF，Landmesser U，et al. Cell-based cardiovascular repair and regeneration in acute myocardial infarction and chronic ischemic cardiomyopathy current status and future developments [J]. Int J Dev Biol，2011，55（4-5）：407-417.

[11] 陳杰民，涂昌，梁逸仙，等.不穩(wěn)定型心絞痛患者外周血內(nèi)皮祖細胞與冠狀動脈狹窄程度的關系[J].陜西醫(yī)學雜志，2013，42（4）：409-411.