PI3K/Akt/mTOR 信號通路在巨噬細胞自噬及動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定中的作用*

王和峰， 翟純剛， 龐文會， 王 晨， 楊 敏，趙 凱， 李大慶， 張 運， 李繼福△， 陳文強△

(1山東大學齊魯醫(yī)院心內(nèi)科，山東 濟南250012;2山東大學附屬省立醫(yī)院，山東 濟南250021)

大量證據(jù)表明動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)展是個慢性炎癥過程，而AS 斑塊的急性炎癥是導致斑塊破裂、促進急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)發(fā)生的關(guān)鍵因素，炎癥反應是斑塊易損性最重要的內(nèi)在因素之一［1］。斑塊中的巨噬細胞是斑塊炎癥反應的關(guān)鍵因素。如何減少斑塊中的巨噬細胞的浸潤，促進易損斑塊的穩(wěn)定已引起國內(nèi)外學者的高度重視。

研究發(fā)現(xiàn)AS 斑塊中巨噬細胞的變化與細胞的自噬(autophagy)關(guān)系密切，自噬參與了AS 的發(fā)生、發(fā)展過程［2］。自噬是保持細胞穩(wěn)態(tài)重要的過程，可以被饑餓、病原入侵、細胞分化以及正常生長的調(diào)節(jié)所誘導。自噬表現(xiàn)為細胞生長過程中形成的能夠降解長壽命蛋白以及自體多余的或失去功能的細胞器的功能。研究發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號通路在自噬中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，針對該信號通路選擇抑制性藥物治療腫瘤已經(jīng)取得較為滿意的效果［3-5］。本研究擬選擇Akt抑制劑康士得(casodex)、mTOR 抑制劑雷帕霉素(rapamycin)及mTOR-siRNA 選擇性抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路，促進巨噬細胞自噬，探尋抑制斑塊炎癥的可能機制和穩(wěn)定易損斑塊治療的新策略。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 實驗細胞與動物 小鼠巨噬細胞株RAW 264.7 購自中國科學院上海生命科學研究所;雄性純種新西蘭大白兔24 只，體重1.5 ～2.5 kg，購自山東省農(nóng)業(yè)科學院。

1.2 試劑和藥品 口服雷帕霉素(純度98%)，購于上海中康偉業(yè)生物科技有限公司;細胞干預雷帕霉素購自Calibiochem;口服康士得購自阿斯利康制藥有限公司;細胞干預康士得(B9061)購自Sigma;RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas;實時熒光定量PCR 試劑盒購自TaKaRa;蛋白提取試劑盒購自碧云天公司;抗體p-mTOR(#5536)、mTOR(#2983)、p-Akt(#4056)、Akt(#9272)和LC3－Ⅱ(#3868)購自Cell Signaling;RAM-11(MO63301)抗體購自Dako;siRNA 購自廣州瑞博生物科技有限公司;白細胞介素4(interleukin 4，IL-4)、白細胞介素10(interleukin 10，IL-10)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)和白細胞介素2(interleukin 2，IL-2)ELISA 試劑盒購自eBioscience。

1.3 儀器 JEM-1200 透射電子顯微鏡購自JEOL，iLab 血管內(nèi)超聲儀購自Boston Scientific。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及分組 小鼠巨噬細胞RAW 264.7生長在RPMI-1640 培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)細胞，用相應試劑處理，取對數(shù)生長期的細胞，培養(yǎng)24 h 后，隨機分為空白對照組、康士得組［康士得(20 μmol/L)共培養(yǎng)細胞48 h］、雷帕霉素組［雷帕霉素(10 nmol/L)共培養(yǎng)細胞48 h］以及siRNA 組［mTOR-siRNA(30 nmol/L)共培養(yǎng)細胞48 h］。

2.2 AS 動物模型的復制 24 只雄性新西蘭純種兔給予球囊損傷+高脂喂養(yǎng)(1%膽固醇，每只120 ～140 g·d－1)喂養(yǎng)8 周，8 周末隨機分為對照組、康士得(1.0 mg·kg－1·d－1)組和雷帕霉素(0.5 mg·kg－1·d－1)組，每組8 只，干預4 周。

2.3 血管內(nèi)超聲( intravascular ultrasound，IVUS) 檢查 采用血管內(nèi)超聲儀進行病變部位的檢查，血管內(nèi)超聲探頭為3.2 F，頻率為40 MHz。血管內(nèi)超聲探頭導管通過狹窄病變至血管遠端，然后以0.5 mm/s 的速度緩慢回撤探頭導管，標記斑塊遠端、近端圖像，錄像供脫機分析和存檔。

2.4 透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu) 藥物共培養(yǎng)巨噬細胞48 h 后，收取各組細胞置于3%戊二醛中固定、PBS 洗滌、1%餓酸固定、梯度乙醇丙酮脫水、包埋、聚合、超薄切片、鉛染后觀察。干預動物4 周末，處死動物，分離腹主動脈血管段，處理方法同上。

2.5 細胞免疫熒光標記 24 孔板細胞爬片，2%多聚甲醛固定共培養(yǎng)的細胞，PBS 沖洗后，1% Triton X-100 細胞透入，5%BSA (牛血清白蛋白)封閉，加入相應Ⅰ抗后4 ℃孵育過夜。PBS 沖洗后，加入熒光Ⅱ抗，室溫避光孵2 h，DAPI 染細胞核后，放熒光淬滅劑封片，共聚焦顯微鏡下觀察。

2.6 Western blotting 檢測細胞中總Akt、總mTOR、磷酸化Akt( p-Akt) 、磷酸化mTOR( p-mTOR) 及LC-3-Ⅱ蛋白的表達 收獲細胞，PBS 洗滌3 次，用試劑盒提取蛋白后，采用BCA 蛋白定量法測定蛋白濃度。6% ～15%SDS 聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，蛋白分離后200 mA 轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上。室溫下5%脫脂奶粉封閉膜2 h，用相應的Ⅰ抗4 ℃孵育膜過夜，洗滌后換HRP 標記Ⅱ抗室溫孵育2 h。洗滌后采用化學發(fā)光試劑盒在GE ImageQuant LAS 4000 mini 超靈敏化學發(fā)光成像儀顯影，使用ImageJ 的軟件分析條帶灰度值。

2.7 實時熒光定量RT-PCR 檢測Akt、mTOR 和Beclin 1 的mRNA 表達 巨噬細胞總RNA 分離提取，反向轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板，采用SYBR Green進行實時熒光PCR 反應;反應參數(shù):95 ℃30 s，1 個循環(huán);95 ℃5 s，55 ℃10 s，40 個循環(huán)，樣本中目的基因的計算方法為2－ΔΔCt［6］。小鼠Akt 上游引物5’-AGTCCCCACTCAACAACTTCT-3’，下 游 引 物 5’-GAAGGTGCGCTCAATGACTG-3’;小鼠mTOR 上游引物5’-CAGTTCGCCAGTGGACTGAAG-3’，下游引物5’-GCTGGTCATAGAAGCGAGAC-3’;小鼠Beclin 1 上游引物5’-GTCCACGCTCGACCTTCTTAC-3’，下游引物5’-CACTTGCCAGTCTTAACCTCTG-3’;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參照，小鼠GAPDH上游引物5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’。

2.8 巨噬細胞分泌炎癥因子測定 取共培養(yǎng)48 h的細胞上清液，用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定IFN-γ、IL-4、IL-10 和IL-2 的水平。嚴格按照ELISA試劑盒說明操作，IL-4、1L-10、IFN-γ 和IL-2 的可測范圍分別為4 ～500、30 ～4 000、15 ～2 000 和2 ～200 ng/L，重復3 次實驗，平行各組上清液標本檢測3 次。

2.9 HE 染色及組織免疫組化染色 分離腹主動脈標本固定在4%多聚甲醛1 ～2 d。梯度乙醇脫水、透明、石蠟包埋?？酒撓炛了?，抗原修復后，免疫組化染色:3% 雙氧水室溫作用15 min，血清封閉15 min 后，加相應Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜，洗滌后Ⅱ抗室溫孵育1 h，DAB 顯色，蘇木素染色后，脫水透明及封片。HE 染色:蘇木素染色后，用水沖洗，1%鹽酸乙醇脫水，再用水沖洗，伊紅染色，梯度乙醇脫水透明并中性樹膠封片。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標準差(mean ± SD)表示，應用SPSS 13.0 軟件處理，采用單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 體外細胞研究結(jié)果

1.1 透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu) 藥物共培養(yǎng)巨噬細胞48 h 后，與對照組比較，康士得組、雷帕霉素及mTOR-siRNA 組的自噬體均顯著增加，見圖1。

Figure 1. Transmission electron microscopy revealed that autophagosomes (indicated by arrows)in casodex，rapamycin and mTOR-siRNA groups were significantly increased as compared with control group. A:control;B:casodex;C:rapamycin;D:mTOR-siRNA.圖1 透射電鏡顯示對照組、康士得組、雷帕霉素組及mTOR-siRNA 組的自噬體

1.2 細胞免疫熒光標記 與對照組比較，康士得組、雷帕霉素及mTOR-siRNA 組的微管相關(guān)蛋白LC3-II 的表達均增加，見圖2A。

1.3 Western blotting 檢測結(jié)果 與對照組比較，康士得組、雷帕霉素及mTOR-siRNA 組的微管相關(guān)蛋白LC3-II 表達均顯著增加(均P ＜0.01)，見圖2B;而p-Akt 及p-mTOR 蛋白表達均顯著減少(均P ＜0.01);Akt 蛋白表達均未見顯著差異;mTOR 蛋白表達在mTOR-siRNA 組顯著減少(P ＜0.01)，而在康士得和雷帕霉素組未見顯著差異，見圖3。

Figure 2. Both cell immunofluorescence (A;× 400)and Western blotting (B)showed that microtubule-associated protein LC3-II expression in casodex，rapamycin and mTOR-siRNA groups was significantly higher than that in control group. Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control group.圖2 對照組、康士得組、雷帕霉素組及mTOR-siRNA 組微管相關(guān)蛋白LC3-II 的表達

Figure 3. The expression of p-AKT and p-mTOR detected by Western blotting in control，casodex，rapamycin and mTORsiRNA groups. Mean ±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control group.圖3 對照組、康士得組、雷帕霉素組及mTOR-siRNA 組的p-Akt 及p-mTOR 的表達

1.4 實時熒光定量RT-PCR 檢測結(jié)果 與對照組相比較，康士得組(1.73 ±0.07)、雷帕霉素組(3.61±0.38)及mTOR-siRNA 組(3.83 ±0.18)的自噬相關(guān)蛋白Beclin 1 mRNA 相對表達水平顯著上調(diào)(P ＜0.05，P ＜0.01);與對照組相比較，康士得組(0.10±0.01)、雷帕霉素組(0.25 ±0.01)及mTOR-siRNA組(0.22 ±0.03)的Akt mRNA 相對表達水平顯著下調(diào)(均P ＜0.01);與對照組相比較，康士得組(0.35±0.04)、雷帕霉素組(0.11 ±0.02)及mTOR-siRNA組(0.12 ±0.02)的mTOR mRNA 相對表達水平顯著下調(diào)(均P ＜0.01)，見圖4。

1.5 巨噬細胞分泌的炎癥因子 (1)IL-10 水平:與對照組［(221.10 ±3.70)ng/L］比較，康士得組［(170.90 ±6.08)ng/L］、雷帕霉素組［(112.70 ±8.81)ng/L］及mTOR-siRNA 組［(119.70 ±11.15)ng/L］明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01);(2)IFN-γ水平:與對照組［(11.32 ±0.42)ng/L］比較，康士得組［(12.88±1.02)ng/L］未見顯著差異，雷帕霉素組［(17.41 ±1.19)ng/L］及mTOR-siRNA 組［(17.18 ±1.10)ng/L］顯著增加(P ＜0.05);(3)與對照組比較，IL-4 及IL-2 的分泌未見顯著差異，見圖5。

Figure 5. Concentrations of IL-4，IL-10，IL-2 and IFN-γ in cell culture supernatants detected by ELISA. Mean ±SD.n =3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.圖5 細胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-10、IL-2 和IFN-γ 的含量

2 動物實驗研究結(jié)果

2.1 IVUS 檢測結(jié)果 與對照組比較，康士得組及雷帕霉素組的外彈性膜面積(external elastic membrane area，EEMA)、斑塊面積(plaque area，PA)及斑塊負荷(plaque burden，PB)明顯減少(均P ＜0.05)，見表1。

表1 3 組兔干預4 周時IVUS 檢測結(jié)果的比較Table 1. IVUS results of the rabbits after 4 weeks of intervention(mean±SD.n=8)

2.2 組織透射電鏡檢測結(jié)果 與對照組相比較，康士得組及雷帕霉素組斑塊組織中的自噬體顯著增多，其特點是細胞收縮，廣泛空泡化，細胞器的減少，見圖6。

2.3 組織免疫熒光法 與對照組相比較，康士得組［(23.12 ± 1.72)%］及 雷帕 霉 素組［(46.13 ±3.29)%］的微管相關(guān)蛋白LC3-II 面積/斑塊面積的比例顯著增加(均P ＜0.01)，見圖7。

2.4 HE 染色 與對照組比較，康士得組及雷帕霉素組的斑塊纖維帽厚度不同程度地升高，內(nèi)、中膜厚度減低(均P ＜0.01)，見圖8。

2.5 免疫組織化學染色 與對照組相比，康士得組(0.62 ±0.09)及雷帕霉素組(0.05 ±0.01)巨噬細胞RAM-11 的相對表達顯著減少(P ＜0.05，P ＜0.01)，見圖9;與對照組相比較，康士得組(0.80 ±0.04)及雷帕霉素組(0.10 ±0.02)的p-mTOR 相對表達顯著減少(P ＜0.05，P ＜0.01)，見圖10。

Figure 6. Transmission electron microscopy revealed that more typical autophagosomes (indicated by arrows)were detected in plaques of casodex and rapamycin groups as compared with control group. A:macrophage in plaques;B:control;C:casodex;D:rapamycin.圖6 透射電鏡觀察對照組、康士得組及雷帕霉素組斑塊中的自噬體

討 論

ACS 主要是由于AS 易損斑塊破裂、血栓形成造成冠狀動脈急性閉塞所致。因此，斑塊易損性已成為國內(nèi)外研究的熱點問題。斑塊是否破裂取決于斑塊內(nèi)在特性和外在因素的共同作用，而前者是斑塊不穩(wěn)定性的決定因素。深入研究斑塊不穩(wěn)定性的發(fā)生機制，使易損斑塊向穩(wěn)定的方向轉(zhuǎn)變，是預防ACS的重要方法。

通過對ACS 病人的尸檢中發(fā)現(xiàn)冠狀動脈斑塊中存在大量的巨噬細胞、淋巴細胞和肥大細胞，其中巨噬細胞是破裂斑塊中細胞的主要成分。斑塊的纖維帽中侵入的巨噬細胞越多，斑塊就越脆弱，這與巨噬細胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，降解細胞外基質(zhì)導致纖維帽變薄有關(guān)。同時，在斑塊破裂過程中，巨噬細胞分泌大量的炎性因子，促進斑塊向不穩(wěn)定方向轉(zhuǎn)化［7］。因此，斑塊中的巨噬細胞是斑塊不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素，如何減少斑塊中的巨噬細胞的浸潤，促進易損斑塊的穩(wěn)定已引起國內(nèi)外學者的高度重視。

Figure 7. The ratio of LC3-II area to plaque area detected by immunofluorescence (×40). Mean±SD.n=8. ＊＊P ＜0.01 vs control group.圖7 細胞免疫熒光標記觀察各組LC3-II 面積/斑塊面積

Figure 8. Thickness of the fibrous cap in casodex and rapamycin groups was higher than that in control group，while intima-media thickness was significantly reduced(HE staining，×40). Mean±SD.n=8. ＊＊P ＜0.01 vs control group.圖8 HE 染色觀察對照組、康士得組及雷帕霉素組的斑塊纖維帽及內(nèi)、中膜厚度

Figure 9. RAM-11 expression in macrophages detected by immunohistochemical staining (×40). Mean±SD.n=8. * P ＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.圖9 免疫組織化學觀察各組巨噬細胞RAM-11 表達

Figure 10. p-mTOR expression in casodex and rapamycin groups was significantly reduced as compared with control group detected by immunohistochemical staining (×40). Mean±SD.n=8. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.圖10 免疫組織化學染色觀察對照組、康士得組及雷帕霉素組的p-mTOR 表達

自噬顧名思義為“自食”，是一種在細胞溶酶體中降解蛋白質(zhì)和細胞器漸進的相對保守的機制。基礎(chǔ)自噬代表了一種修復，維持生命的過程，但毫無控制的自噬活動會促進細胞死亡［8］。研究表明，自噬在AS 形成和發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)因素。在AS 早期，巨噬細胞的自噬減少了泡沫細胞的積聚，抑制了斑塊的形成和發(fā)展。在AS 的中晚期，巨噬細胞的自噬減少斑塊中的炎癥反應，起到穩(wěn)定斑塊的作用，而平滑肌細胞的自噬促進纖維帽變薄，使斑塊向不穩(wěn)定方向發(fā)展。Martinet 等［2］認為低密度脂蛋白、炎癥以及代謝性應激可以促進AS 斑塊中細胞的自噬。斑塊細胞的自我吞噬是斑塊細胞通過降解損傷的細胞器從而防止外部氧化應激損害。Verheye 等［9］利用掃描電鏡、免疫組織化學染色等方法發(fā)現(xiàn)AS 斑塊中巨噬細胞和平滑肌細胞均存在自噬現(xiàn)象。Altman等［4］研究發(fā)現(xiàn)氧化應激能夠引起斑塊細胞的自噬，其中PI3K/Akt/mTOR 信號通路起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。

國內(nèi)外學者已經(jīng)針對PI3K/Akt/mTOR 信號轉(zhuǎn)導通路選擇抑制性藥物治療腫瘤。Ghosh 等［10］研究發(fā)現(xiàn)雄激素依賴性前列腺癌細胞株LNCaP 和雄激素非依賴性前列腺癌細胞株C4-2 均能被PI3K 抑制劑LY294002 而不能被 MAPK/ERK 激酶抑制劑PD98059 抑制;Akt 抑制劑康士得導致LNCaP 細胞生長阻滯，卻不能抑制C4-2 細胞的增殖。mTOR 抑制劑雷帕霉素可以使C4-2 細胞增殖水平下降50%［11］。最近研究發(fā)現(xiàn)利用藥物依維莫司和雷帕霉素抑制mTOR，通過促進腫瘤細胞的自噬而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展［12］。

我們通過體外巨噬細胞以及體內(nèi)AS 不穩(wěn)定斑塊兔模型的研究發(fā)現(xiàn)，利用Akt 抑制劑康士得、mTOR 抑制劑雷帕霉素及mTOR-siRNA 干預巨噬細胞或AS 家兔后，Akt 及mTOR 的表達明顯減少，說明可以有效地阻斷PI3K/Akt/mTOR 信號轉(zhuǎn)導通路。經(jīng)干預后，巨噬細胞自噬現(xiàn)象明顯增強，表現(xiàn)為透射電鏡下觀察自噬體明顯增多，微管相關(guān)蛋白LC3-II和自噬相關(guān)蛋白Beclin 1 的表達水平明顯上調(diào)。微管相關(guān)蛋白LC3 最初合成一個未處理的形式即前體LC3，但立即被Atg4 裂解，產(chǎn)生一種活躍的細胞溶質(zhì)形式被稱為LC3-I。隨著Atg7 的催化和E2 酶Atg3的結(jié)合，LC3-I 和豐富的膜磷脂即磷脂酰乙醇胺相互作用產(chǎn)生了LC3-II。脂化反應導致了LC3 的構(gòu)象變化，這對自噬體的形成非常重要。因為LC3-II 的相對量反映了自噬體的含量，這種LC3 亞型是目前最廣泛用來檢測自噬體的分子標記。Beclin 1 基因是第一個確認的哺乳動物的自噬基因，也是第一個確認的在自噬溶酶體降解途徑中起腫瘤抑制的基因，對自噬體的形成至關(guān)重要［13］。本研究結(jié)果充分說明，選擇性抑制PI3K/Akt/mTOR 信號轉(zhuǎn)導通路能夠明顯促進巨噬細胞的自噬現(xiàn)象。

體外巨噬細胞的干預研究顯示，經(jīng)康士得、雷帕霉素或mTOR-siRNA 選擇性抑制PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導通路后，巨噬細胞分泌的IL-10 明顯降低，而IFN-γ 的分泌顯著增加，表明炎癥反應明顯降低。體內(nèi)動物研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)康士得或雷帕霉素干預后，IVUS 顯示康士得組及雷帕霉素組的外彈性膜面積、斑塊面積及斑塊負荷與對照組比較均明顯減少，病理學檢測發(fā)現(xiàn)AS 斑塊中巨噬細胞RAM-11 染色明顯減少，斑塊纖維帽的厚度不同程度地升高，內(nèi)、中膜厚度減低。以上結(jié)果表明阻斷信號通路后可以明顯降低炎性反應，使AS 斑塊逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定斑塊。

總之，選擇性抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路能誘導巨噬細胞自噬，減少斑塊巨噬細胞的浸潤，抑制炎癥反應進而穩(wěn)定動脈粥樣硬化易損斑塊。

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