CdTe量子點(diǎn)雙層加殼增強(qiáng)其化學(xué)和生物穩(wěn)定性

裴國(guó)鳳，王海波，向榮華，梁曉聲

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢430074)

作為一種新型的熒光材料，量子點(diǎn)具有激發(fā)光譜寬，分布連續(xù)，發(fā)射光譜呈對(duì)稱(chēng)性且半峰寬較窄，顏色可調(diào)的優(yōu)勢(shì)，與傳統(tǒng)的有機(jī)染料相比其熒光壽命長(zhǎng)、QDs穩(wěn)定性好、熒光雜質(zhì)少、不易漂白、與生物體鏈接后不影響其活性、特異性高，在生命科學(xué)中具有廣闊的應(yīng)用前景[1-3].量子點(diǎn)與熒光小分子相比亮度和穩(wěn)定性均較大提高，但量子點(diǎn)在加熱、高離子強(qiáng)度、氧化還原環(huán)境、金屬離子等情況下均發(fā)生焠滅，嚴(yán)重地制約了量子點(diǎn)的應(yīng)用.目前量子點(diǎn)熒光影像監(jiān)測(cè)對(duì)病毒侵染等短時(shí)段行為的研究揭示了很多相關(guān)生物學(xué)問(wèn)題.但對(duì)于較難生長(zhǎng)的微生物，腸道菌群微生態(tài)的建立和變化，高等動(dòng)植物的發(fā)育等過(guò)程，量子點(diǎn)還無(wú)法做到實(shí)時(shí)全程監(jiān)測(cè).

研究發(fā)現(xiàn)在合成完成量子點(diǎn)后再換用更穩(wěn)溫和無(wú)毒的元素(硫、鋅等)進(jìn)行加殼可大大提高量子點(diǎn)的量子效率、穩(wěn)定性和生物相容性. Alivisatos等[4]利用硅酸酯水解技術(shù)首創(chuàng)了量子點(diǎn)的氧化硅結(jié)果包殼，使得量子點(diǎn)易于與蛋白和核酸等交聯(lián).水熱合成量子點(diǎn)熒光效率高、合成簡(jiǎn)單、無(wú)需水/油相轉(zhuǎn)化，降低了量子點(diǎn)合成成本.利用硅酸酯的Stober水解法用于合成抗熱量子點(diǎn)或改善其熒光效率[5].基于Stober硅烷水解技術(shù)，本文設(shè)計(jì)了氨基硅烷試劑和硅酸酯2步水解，對(duì)量子點(diǎn)進(jìn)行2步加殼，合成了熱、化學(xué)、生物穩(wěn)定性較好，適合超長(zhǎng)時(shí)間影像的雙層加殼量子點(diǎn)，最長(zhǎng)可達(dá)7 d的熒光監(jiān)測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品、試劑和儀器

氨水(武漢洪山中南化工試劑有限公司)，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(純度98.0％，上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)，正硅酸乙酯(TEOS，純度98.0％，F(xiàn)luka公司)，還原型谷胱甘肽(Sigma公司)，酵母浸粉和蛋白胨(Oxiod公司).葡萄糖、蘋(píng)果酸、KH2PO4、NaBH4、CdCl2·2.5H2O、Na2TeO3、EDTA-Na2、CdCl2·6H2O、NaCl、I2、MgSO4·7H2O 、(NH4)2SO4、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，水為millpore超純水.

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)，F(xiàn)A1004電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，電子萬(wàn)用爐(北京永光明醫(yī)療儀器廠)，QYD-200全溫培養(yǎng)搖床(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，WD-9403E型手提紫外燈(北京六一儀器廠)，GeneGenius凝膠成像系統(tǒng)(Synoptics公司)，熒光光度計(jì)(F-2500，日本日立)，透射電子顯微鏡(H7650，日本日立).

1.2 CdTe量子點(diǎn)的合成及加殼

1.2.1 CdTe量子點(diǎn)的合成

量子點(diǎn)參照文獻(xiàn)[6]合成，具體步驟為：依次將0.04 M CdCl216 mL，檸檬酸鈉400 mg，蘋(píng)果酸400mg，0.01 M Na2TeO316 mL，NaBH4200 mg加入三口圓底燒瓶中，補(bǔ)水至200 mL.在強(qiáng)磁力攪拌下加熱至沸進(jìn)行反應(yīng)，約95 min后在紫外激發(fā)下有近550 nm綠色熒光時(shí)停止反應(yīng)，得到發(fā)射峰約為550 nm的CdTe量子點(diǎn)膠體溶液.加入適量丙酮，離心棄上清，沉淀水重懸，稀釋后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)算濃度[7,8].

1.2.2 CdTe量子點(diǎn)的加殼

取5支10 mL的離心管加入6 mL純化后的量子點(diǎn)(10 μM)加300 μL 6.25％氨水混勻，其中再分別加12 μL 的r(H2O︰C9H23NO3Si)=30︰1,60︰1,120︰1,240︰1 (C9H23NO3Si為3-氨基丙基三乙氧基硅烷)的混合試劑；置于搖床中避光振蕩1 h，使C9H23NO3Si能均勻地包覆在CdTe量子點(diǎn)的外面，再加入1188 μL 的r(H2O︰TEOS)=120︰1的混合試劑置于避光搖床中，振蕩過(guò)夜.丙酮沉淀?xiàng)壣锨?，純水重?

1.3 利用量子點(diǎn)熱抗性對(duì)加殼條件優(yōu)化

取等濃度不同C9H23NO3Si加殼條件量子點(diǎn)各1 mL加入去離子水3 mL，在沸水浴中加熱，每隔15 min取樣60 μL，加熱90 min，共取樣7次， 用熒光分光光度計(jì)測(cè)其熒光發(fā)射峰面積，得出各種加殼條件量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度隨加熱時(shí)間的變化對(duì)比圖.

1.4 量子點(diǎn)的表征

1.4.1 量子點(diǎn)的熒光表征

取用優(yōu)化條件加殼得到的量子點(diǎn)及為加殼的量子點(diǎn)對(duì)照，適當(dāng)稀釋與熒光分光光度計(jì)在380 nm激發(fā)光下測(cè)定其450～650 nm發(fā)射峰，測(cè)定數(shù)值以峰值為1進(jìn)行歸一化處理.

1.4.2 量子點(diǎn)的透射電子顯微鏡表征

滴一滴量子點(diǎn)溶液至封口膜上，把銅網(wǎng)的碳支持膜面蓋在液滴上固定數(shù)分鐘后，銅網(wǎng)蓋在醋酸雙氧鈾液滴1～2 min，上自然干燥后制得TEM 樣品.TEM 樣品用透射電鏡進(jìn)行觀察.

1.5 加殼量子點(diǎn)多種化學(xué)因素抗性評(píng)估

對(duì)半稀釋法配制EDTA 5,2.5,1.25,0.625,0.3125 mM.取一塊多孔板，向前三排中每孔加入100 μL 10 μM的CdTe量子點(diǎn)，后三排孔中每孔加入100μL 10 μM 的r(H2O︰C9H23NO3Si)=60︰1加殼CdTe量子點(diǎn).向上述對(duì)應(yīng)的量子點(diǎn)中每列依次加入配置好的EDTA溶液10 μL，根據(jù)量子點(diǎn)的淬滅情況(未加殼的量子點(diǎn)淬滅，加殼的量子點(diǎn)未淬滅)，獲得最有差異效果的EDTA濃度.類(lèi)似依次做CdCl2、NaCl、I2、FeSO4、FeCl3、巰基還原劑、CoCl2的濃度梯度，獲得最有差異效果的濃度.

同上分別配置最有差異效果濃度的EDTA、CdCl2、NaCl、I2、FeSO4、FeCl3、CoCl2和還原型谷胱甘肽溶液，檢測(cè)金屬離子對(duì)加殼量子點(diǎn)和未加殼量子點(diǎn)穩(wěn)定性的影響.分別加入100 μL 10 μM的CdTe量子點(diǎn)和同樣濃度的加殼量子點(diǎn)，10 μL上述絡(luò)合劑、金屬離子和氧化還原試劑，混合均勻，5 min后熒光分光光度計(jì)測(cè)定剩余熒光強(qiáng)度.

1.6 加殼量子點(diǎn)用于微生物超長(zhǎng)時(shí)間影像

LB培養(yǎng)基分別培養(yǎng)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌K12株至對(duì)數(shù)期，8000 g×5 min離心，棄上清，沉淀用合成培養(yǎng)基(配方為：2％葡萄糖，0.5％硫酸銨，0.05％磷酸氫二鉀，0.001％七水硫酸亞鐵，0.02％七水硫酸鎂)洗滌1次，再離心，棄上清，沉淀用合成培養(yǎng)基稀釋至OD為1.培養(yǎng)液中加入1/10 (V/V) 10 μM的加殼量子點(diǎn)，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以2 h為間隔取樣至熒光分光光度計(jì)測(cè)定至無(wú)熒光.

2 結(jié)果與討論

2.1 利用量子點(diǎn)熱抗性對(duì)加殼條件的優(yōu)化

量子點(diǎn)通過(guò)二次加殼，可獲得除熱穩(wěn)定性以外的對(duì)離子、螯合劑、氧化還原劑等不同程度的抗性.其抗性的獲得取決于第一步氨基硅烷化試劑在量子點(diǎn)顆粒表面水解聚合形成有自由氨基的保護(hù)殼，加殼程度與其穩(wěn)定性密切相關(guān).本文以熱穩(wěn)定性為考核指標(biāo)，優(yōu)化了第一步氨基硅烷化試劑加殼劑量，結(jié)果見(jiàn)圖1.如圖1所示，與未加殼量子點(diǎn)相比，加殼量子點(diǎn)在熱穩(wěn)定性、加熱后量子效率方面均有了顯著的提高.以r(H2O︰C9H23NO3Si)=60︰1條件加殼的CdTe量子點(diǎn)提高熒光強(qiáng)度最為顯著.因納米材料為亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)，熱能加快表面離子和分子的熱運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致表面的鎘和碲等元素從納米顆粒上脫落下來(lái)，造成量子點(diǎn)熒光的減弱甚至焠滅.通過(guò)加殼限制表面離子的運(yùn)動(dòng)，提高了穩(wěn)定性.本文在加殼材料中引入了氨基，氨基可與鎘離子發(fā)生絡(luò)合，在量子點(diǎn)周?chē)纬筛哝k離子濃度的區(qū)域，使得表面離子更易達(dá)到吸附平衡不易脫落. 以r(H2O︰C9H23NO3Si)=60︰1加殼的CdTe量子點(diǎn)熱抗性最高，說(shuō)明引入的氨基有效性最高，故后續(xù)表征和實(shí)驗(yàn)均以該條件加殼的量子點(diǎn)來(lái)進(jìn)行.

1)未加殼量子點(diǎn)；2～4) 分別為r(H2O︰C9H23NO3Si)=60︰1,120︰1,240︰1的加殼CdTe量子點(diǎn)

2.2 加殼量子點(diǎn)的表征

加殼量子點(diǎn)的TEM圖結(jié)果見(jiàn)圖2.由圖2可見(jiàn)，量子點(diǎn)未加殼為點(diǎn)狀，直徑在5 nm以下，與文獻(xiàn)報(bào)道符合，經(jīng)加殼后不同納米顆粒間的機(jī)硅酸酯水解相連形成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).未見(jiàn)明顯的沉淀，故可以用于組織靶向、動(dòng)物活體成像等方面.

a) 發(fā)射峰約550 nm未加殼量子點(diǎn)的TEM圖； b) 發(fā)射峰約550 nm加殼量子點(diǎn)的TEM圖

通過(guò)熒光分光光度計(jì)表征發(fā)量子點(diǎn)包殼前后發(fā)射光譜，結(jié)果如圖3.圖3顯示未加殼量子點(diǎn)發(fā)射峰峰型較好，半峰寬較窄約50 nm，加殼后半峰寬變?yōu)?00 nm左右.另外，加殼后最大發(fā)射峰發(fā)生輕微藍(lán)移，說(shuō)明在包殼過(guò)程中隨著硅殼包覆，表面結(jié)合不夠緊密的鎘碲等離子丟失.因量子點(diǎn)發(fā)射光譜與直徑相關(guān)，直徑越小發(fā)射波長(zhǎng)越短，加殼后半峰寬變寬表明量子點(diǎn)單分散性變差，顆粒大小不均一程度變大.

λ/nm

2.3 加殼量子點(diǎn)多種化學(xué)因素抗性

分別對(duì)加殼量子點(diǎn)進(jìn)行了EDTA、CdCl2、NaCl、I2、FeSO4、FeCl3、CoCl2和還原型谷胱甘肽等化學(xué)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4.由圖4可見(jiàn)，圖中顯示除EDTA、CdCl2、CoCl2外，加殼量子點(diǎn)均較未加殼量子點(diǎn)抗性增強(qiáng)，尤其對(duì)高達(dá)0.5 M的氯化鈉和遠(yuǎn)高于細(xì)胞內(nèi)濃度的谷胱甘肽，說(shuō)明該材料可適應(yīng)大多數(shù)生化體內(nèi)體外反映的條件.EDTA加殼未顯示出良好的抗性則與其絡(luò)合穩(wěn)定常數(shù)太大有關(guān).鎘離子及鈷離子顯示了相反的趨勢(shì)是由于前兩者結(jié)合到量子點(diǎn)表面使量子點(diǎn)有效粒徑變大，其發(fā)射峰往長(zhǎng)波長(zhǎng)紅移.黃色量子效率最高[9]，本文所有量子點(diǎn)為黃綠色，紅移往黃色移，故量子效率除了受金屬離子負(fù)影響外還會(huì)有一定的增加，而包殼后的量子點(diǎn)鎘離子被氨基屏蔽則沒(méi)有這種增益效果.

1)加殼量子點(diǎn)；2) 未加殼量子點(diǎn)

2.4 加殼量子點(diǎn)用于微生物超長(zhǎng)時(shí)間影像

以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為例估加殼對(duì)其生物穩(wěn)定性的影響.圖5中顯示，與金黃色葡萄球菌共同培養(yǎng)12 h，未加殼量子點(diǎn)熒光完全焠滅，而加殼量子點(diǎn)熒光還有80％以上剩余，直至168h以后才完全焠滅.可用于長(zhǎng)達(dá)7 d的活體成像或腸道微生態(tài)影像，甚或一些難生長(zhǎng)的微生物.與革蘭氏陰性菌大腸桿菌K12株培養(yǎng)8 h，包殼量子點(diǎn)熒光完全焠滅，而加殼量子點(diǎn)至48h熒光才完全焠滅，因不同菌株產(chǎn)酸等能力有差異.

3 結(jié)論

(1)采用Stober法進(jìn)行了量子點(diǎn)加殼，首創(chuàng)了3-氨基丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙酯2步水解加殼法，優(yōu)化了加殼條件合成雙層加殼量子點(diǎn).

(2)評(píng)估了該量子點(diǎn)的化學(xué)穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)金屬離子，氧化還原試劑均有很好抗性.

(3)以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為例，對(duì)加殼量子點(diǎn)超長(zhǎng)時(shí)間生物影像能力進(jìn)行了評(píng)估.發(fā)現(xiàn)其熒光可最多延續(xù)1周才完全焠滅，較未加殼量子點(diǎn)提高了10多倍.

a) 共培養(yǎng)微生物為金黃色葡萄球菌 b) 共培養(yǎng)微生物為大腸桿菌K12株

[1] 張海麗,劉天才,王建浩,等. 量子點(diǎn)成像的新研究進(jìn)展[J].分析化學(xué),2006,34(10): 136-140.

[2] 宋國(guó)利. 量子點(diǎn)的電子結(jié)構(gòu)及量子效應(yīng)[J]. 黑龍江大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版,2002,19(1): 80-83.

[3] 孫寶權(quán),徐詠藍(lán),衣光舜,等. 半導(dǎo)體納米晶體的光致發(fā)光特性及在生物材料熒光標(biāo)記中的應(yīng)用[J]. 分析化學(xué),2002,30(9): 1130-1136.

[4] Gerion D,Pinaud F,Alivisatos A P,et al. Synthesis and properties of biocompatible water-soluble silica-coated CdSe/ZnS semiconductor quantum dots[J].J Phys Chem,2001,105(37): 8861-8871.

[5] Murase N and Yang P. Anomalous photoluminescence in silica-coated semiconductor nanocrystals after heat treatment[J]. Small,2009,5(7): 800-803.

[6] Ying E B,Li D,Dong S J,et al. Synthesis and bio-imaging application of higly luminescent mercaptosuccinic acid-coated CdTe nanocrystals[J]. Plos ONE,2008,3(5): e2222.

[7] Yu W W,Qu L H,Peng X G,et al. Experimental determination of the extinction coefficient of CdTe,CdSe,and CdS nanocrystals[J]. Chem Mater,2003,15:2854-2860.

[8] Leatherdale C A,Bawendi M G.,et al. On the absorption cross section of CdSe nanocrystal quantum dots[J]. J Phys Chem B,2002,106:7619-7622.

[9] Zolotarev K V,Kashirtseva V N,Mishin A V,et al. Assessment of toxicity of Cdse/Cds/Zns/S,S-dihydrolipoic acid/polyacrylic acid quantum dots at danio rerio embryos and larvae[J]. Nanotechnology,2012,914636-914641.