HIF-1—低氧與固有免疫的聯(lián)系者

沙繼斌

(1. 山東體育學(xué)院基礎(chǔ)理論系，濟南 250102； 2. 西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，西安 710049 )

人體是一個多種調(diào)節(jié)機制與調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)并存的復(fù)雜生物體,研究已經(jīng)證實運動應(yīng)激越強烈，則細胞所生成的活性氧數(shù)目越多[1]。大強度劇烈運動在造成機體能量和能源物質(zhì)大量消耗的同時必然產(chǎn)生大量的活性氧，這種作用的積累將對人體帶來深刻的影響。

1 HIF-1是細胞低氧應(yīng)答反應(yīng)的核心分子

人們對低氧作用的研究,先后經(jīng)歷了由經(jīng)典低氧效應(yīng)到促紅細胞生成素(EPO) ,由EPO 到低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1) ,由HIF-1到氧感受器如脯氨酰羥化酶、天冬酰胺酰羥化酶的過程[2]。HIF-1在細胞缺氧應(yīng)答反應(yīng)居于核心地位[3]，其包括HIF-1α與HIF-1β兩個亞基，其中HIF-1β又稱芳香烴受體核轉(zhuǎn)位因子，而HIF-1α只有在低氧濃度下才會被檢測到，當(dāng)氧充足時，HIF-1α即通過一個泛素-蛋白酶通路水解掉，當(dāng)其氧依賴降解區(qū)功能被抑制之后，α亞基即趨于穩(wěn)定。HIF-1α通常在穩(wěn)定后移位入核，與配體芳香烴受體核轉(zhuǎn)位因子結(jié)合，而后通過與低氧應(yīng)答元件的5′端增強子序列結(jié)合而后激活其它特定的基因,可有效調(diào)節(jié)細胞、組織、器官不同水平的缺氧應(yīng)答反應(yīng)以維持氧穩(wěn)態(tài)。在哺乳動物體內(nèi)吸入氣體與組織細胞之間始終存在氧氣濃度梯度差，且不同組織之間差異非常大，由此使不同組織細胞對氧分壓濃度梯度產(chǎn)生了廣泛的適應(yīng)。

低氧反應(yīng)是由周圍環(huán)境氧氣減少誘發(fā)的古老的應(yīng)激反應(yīng)，一般認(rèn)為由HIF-1來控制這個過程[4,5]。研究結(jié)果表明HIF1廣泛參與低氧誘導(dǎo)基因表達的通路，并可受腫瘤抑制基因VHL與血管內(nèi)皮生長因子VEGF等因子的調(diào)節(jié)。

2 固有免疫與NF-κB

固有免疫是機體抵御外來的細菌、病毒及其它有害病原體的古老應(yīng)激反應(yīng)，是維系組織穩(wěn)態(tài)及正常生命的必備先決條件[6]。固有免疫應(yīng)答受到核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的調(diào)控，NF-κB是一類容易二聚化的蛋白，在其活性抑制蛋白被泛素化降解后，移位入細胞核與相應(yīng)的DNA應(yīng)答元件結(jié)合，接下來通過對靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)調(diào)控效應(yīng)分子如抗菌肽的表達。氧化應(yīng)激可激活細胞的NF-κB信號通路，活性氧基團可激活使IκB上的19、23位絲氨酸磷酸化的激酶，進而使p50與p65二聚體移位至細胞核并與靶基因啟動段κB結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄，也就是說細胞的氧化狀態(tài)直接影響到NF-κB的激活[1,7]。

3 炎癥應(yīng)答——低氧與固有免疫的可能交叉點

研究證實氧合作用與機體免疫力密切相關(guān)，在健康人體中，血液中的髓源性細胞要相繼經(jīng)歷肺泡毛細血管(氧分壓約100mmHg)、混合靜脈血(氧分壓約40mmHg)、靜脈毛細血管(氧分壓與組織利用率相關(guān))、淋巴器官(氧分壓約4mmHg)的不同環(huán)境而產(chǎn)生相應(yīng)的代謝性適應(yīng)。這些不斷變化的氧合條件會使得包括巨噬細胞在內(nèi)的固有免疫髓源性效應(yīng)細胞的行為發(fā)生相應(yīng)的調(diào)整，氧氣的利用率是調(diào)節(jié)參與機體免疫防御細胞機能的重要信號[8]，HIF對免疫細胞的有效調(diào)節(jié)使其能夠很好地適應(yīng)不同區(qū)域的氧分壓的條件變化。

如上所述，固有免疫系統(tǒng)的髓源性細胞在正常情況下都處于靜息狀態(tài)，而活性氧誘發(fā)的細胞結(jié)構(gòu)完整性損傷可導(dǎo)致髓源性細胞的激活，進而引發(fā)炎癥反應(yīng)[6， 8]。受損傷組織區(qū)域髓源性細胞的趨化性募集會導(dǎo)致血管通透性增加，由此隨著局部血流增加而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的經(jīng)典特征即：紅、熱、腫、痛與功能障礙。固有免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細胞具有維持可變微環(huán)境的生命力及正常功能的作用，據(jù)此我們認(rèn)為炎癥反應(yīng)可能是低氧與固有免疫的交叉點之一。在機體被感染之后，機體會隨即產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答[8]。固有免疫系統(tǒng)中主要效應(yīng)細胞是多型核白細胞(polymorphonuclear leukocyte,PMN)，多型核白細胞通過氧依賴性以及非氧依賴性的兩方面抗菌系統(tǒng)來發(fā)現(xiàn)、識別、吞噬、最終消滅入侵的病原微生物[6， 9]。 PMN細胞數(shù)目的減少意味著機體免疫機能抑制或者說被感染的危險性增加。

4 HIF-1α是髓源性細胞機能的核心調(diào)節(jié)者

4.1 HIF-1α對NF-κB的影響

HIF-1不僅僅是細胞能量平衡穩(wěn)態(tài)及細胞對低氧適應(yīng)的主要調(diào)節(jié)者。HIF-1同樣可以激活細胞抗病原微生物的活性，有效支持巨噬細胞及上皮化細胞的固有免疫應(yīng)答。已有數(shù)據(jù)證實HIF-1是巨噬細胞、粒細胞、上皮細胞固有免疫活性及炎癥反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)者，它可以誘導(dǎo)參與炎癥反應(yīng)的基因諸如IL-1β、IL-8、TNFα、iNOS及陽離子抗菌肽cathelicidin的轉(zhuǎn)錄，其激活對宿主的防御機能及對細菌感染的應(yīng)答均有顯著影響[7-10]。胞外捕獲是近年來所發(fā)現(xiàn)的除吞噬作用、分泌可溶性抗菌分子之外的髓源性細胞固有免疫應(yīng)答方式[11]，其調(diào)節(jié)因子尚不夠清楚，Nizet教授課題組近期發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)因子α可有效促進肥大細胞胞外捕獲作用,反之如阻斷HIF-1的活性，則肥大細胞胞外捕獲能力下降[12]。以上結(jié)果提示HIF-1可通過化學(xué)信號誘導(dǎo)以及生物物理學(xué)作用對固有免疫應(yīng)答機能進行調(diào)解。

髓源性細胞對抗入侵病原微生物的場所主要是在感染組織的缺氧微環(huán)境中進行，目前已有越來越多的證據(jù)證實HIF-1α增強髓源性細胞的抗菌活性，并且可以提高樹突狀細胞、肥大細胞、上皮細胞的固有免疫機能[6]。Peyssonnaux 等發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α可有效調(diào)節(jié)與機體免疫相關(guān)的PMN的機能，包括影響陽離子抗菌多肽的轉(zhuǎn)錄及影響一氧化氮合酶的合成[13]。Victor Nizet的研究結(jié)果提示如果把髓源性細胞中的HIF-1遺傳性滅活，在向小鼠體內(nèi)注射脂多糖后，動物的降壓反應(yīng)、降溫反應(yīng)都有所下降，存活率提高[14]。Cramer等建立了髓源性細胞HIF-1α選擇性基因敲除技術(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α被選擇性敲除后會直接影響到中性粒細胞的殺菌效價與巨噬細胞的遷移[15]。為分析HIF-1α對炎癥應(yīng)答的作用，研究者建立了選擇性敲除HIF-1α、血管發(fā)生靶基因VEGF、腫瘤抑制因子VHL的實驗?zāi)Ｐ?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α的缺失導(dǎo)致低氧應(yīng)答基因VEGF的活性基本完全喪失，并且使兩個與葡萄糖代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶葡萄糖轉(zhuǎn)運因子1和磷酸甘油酸酯激酶的活性受到抑制。在HIF-1α缺失的巨噬細胞中，我們同樣觀察到了在常氧條件下這3種基因的表達水平顯著下降。這種HIF-1α的條件性缺失會顯著抑制炎癥應(yīng)答，由此我們認(rèn)為髓源性細胞功能具有HIF-1α依賴性，如缺少HIF-1α，其機能受到顯著抑制[16]。在Cramer以及Peyssonnaux的試驗中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α對于機體炎癥應(yīng)答以及巨噬細胞、中性粒細胞的活性具有很好的促進作用。研究發(fā)現(xiàn)，在巨噬細胞及中性粒細胞中，HIF-1α可以被Gram(+)及Gram(-)細菌誘導(dǎo)，這種誘導(dǎo)作用與組織氧合程度無關(guān)[13， 15]。

在100年前探索糖酵解供能在炎癥細胞能量產(chǎn)生中的作用時已有研究者關(guān)注到了無氧糖代謝對免疫細胞功能的重要性。在低氧條件下，基本上所有與糖酵解相關(guān)的酶活性都有所上調(diào)，這種上調(diào)作用均通過HIF-1α來實現(xiàn)。在HIF-1α突變的小鼠中，巨噬細胞與中性粒細胞內(nèi)的ATP水平都顯著下降15%～20%，野生型的甚至下降40%。這種ATP水平的下降與2-脫氧葡萄糖引起的ATP減少相似，這說明HIF-1α對于髓源性細胞的糖酵解能量調(diào)節(jié)具有重要作用[15]。由此可見， HIF-1α在與病原微生物接觸后隨即被激活而后調(diào)節(jié)吞噬細胞的固有免疫機能。我們發(fā)現(xiàn)HIF-1α的增效劑含羞草堿可以增強人體吞噬細胞的活性，可以提高殺滅金黃色葡萄球菌的能力[17]，這種作用具有劑量依賴性。含羞草堿可以有效的減小在鼠類動物皮膚上以金葡菌制備的皮膚感染創(chuàng)面的面積，促進創(chuàng)面愈合。新發(fā)現(xiàn)的一類HIF-1的穩(wěn)定劑AKB-4924自身并沒有直接抑殺細菌作用，但可以通過提高胞內(nèi)HIF-1的水平及增強巨噬細胞與上皮細胞的抗菌活性，有效抑殺對甲氧西林敏感的金葡菌及具有甲氧西林抗性的金葡菌，可以有效提高上皮細胞及巨噬細胞的抗菌活性，其作用超過含羞草堿[18]。

圖1 不同氧分壓條件下HIF-1表達并于NF-κB相互作用示意圖[3]

4.2 HIF-1與抗菌肽表達

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是固有免疫系統(tǒng)的重要成分之一,具有直接抑殺病原微生物與針對宿主進行免疫調(diào)節(jié)的雙重作用[6]。在HIF-1被選擇性敲除的角質(zhì)細胞當(dāng)中，cathelicidin的分泌顯著減少，而壞死區(qū)域皮膚金黃色葡萄球菌的數(shù)量增加，反之，如果與HIF-1結(jié)合的腫瘤抑制蛋白VHL缺失的話，cathelicidin的分泌增加，金黃色葡萄球菌的感染率下降,以上結(jié)果提示HIF-1對于抗菌肽的產(chǎn)生有直接調(diào)節(jié)作用[19]。

5 核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可能是低氧與固有免疫的重要聯(lián)系者

固有免疫應(yīng)答受若干轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，核轉(zhuǎn)錄因子κB是其中的關(guān)鍵因子之一。NF-κB的活性主要受IKK-β的調(diào)控，IKK-β通過調(diào)控IκB磷酸化降解以控制NF-κB的活性。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB與其激活激酶IKK-β是重要的炎癥反應(yīng)因子，也是固有免疫應(yīng)答的必需因子，如不考慮其免疫抑制效應(yīng)，藥理性阻斷IKKβ-NF-κB通路可作為炎癥的治療策略。

在低氧培養(yǎng)的細胞中IKK-β可被適度激活，而脯氨酰羥化酶可抑制其激活，而氧氣濃度依賴的脯氨酰羥化酶又是HIF-1α的重要穩(wěn)定因子，這提示NF-κB與HIF-1之間可能存在密切聯(lián)系。選用IKK-β敲除的小鼠作為實驗對象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NF-κB是HIF-1α必不可少的轉(zhuǎn)錄激活因子，在低氧培養(yǎng)的細胞中及低氧動物的肝臟與腦組織中都必須保有一定NF-κB的活性才能保持HIF-1蛋白的水平[7]。IKK-β基因的缺失會導(dǎo)致HIF-1α靶基因如血管內(nèi)皮生長因子基因誘導(dǎo)失敗，在對抗細菌感染的巨噬細胞中，HIF-1蛋白的積累同樣需要IKK-β的參與，由此可見IKK-β是低氧應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子，可以使之與固有免疫及炎癥應(yīng)答聯(lián)系起來[7]。同時發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)性IKK-β缺失的小鼠中會出現(xiàn)中性粒細胞增多，如果把IKK-β缺乏小鼠中的白介素1受體(IL-1R)清除掉，其血細胞構(gòu)成趨于正常并可避免中性粒細胞引發(fā)炎癥，但與之同時其對細菌易感性大大增加[20]。由此表明炎癥反應(yīng)與機體固有免疫機能之間既存在密切聯(lián)系，又可能存在一定矛盾。有研究表明如果選擇性敲除髓源性細胞中的HIF-1，則可引起致炎因子的水平升高并可提高動物的生存率，這種致炎因子水平的升高與IKK-β對NF-κB的激活有關(guān)[16]。

目前尚難于定論HIF-1與NF-κB之間的調(diào)控關(guān)系，在離體系統(tǒng)當(dāng)中，研究者發(fā)現(xiàn)HIF-α可激活NF-κB，NF-κB則可調(diào)節(jié)HIF-1的轉(zhuǎn)錄。亦有研究認(rèn)為HIF-α的激活可同時伴有NF-κB被抑制[7]。Victor Nizet實驗室利用κB抑制蛋白激酶基因敲除小鼠作為動物模型，證實了NF-κB是HIF-1α必不可缺的轉(zhuǎn)錄激活因子[21]。在低氧條件下培養(yǎng)的細胞中，κB抑制蛋白激酶的β亞基的活性會有所增加，而脯氨酰羥化酶則可以抑制這種激活作用從而HIF-1的α亞基穩(wěn)定性增強，也就意味著HIF-1活性的增強。在低氧條件下動物的肝與腦中，NF-κB必須保持一定的活性才能保證HIF-1α的數(shù)量[21， 22]。由于κB抑制蛋白激酶的β亞基的缺失，導(dǎo)致諸如血管內(nèi)皮生長因子之類的HIF-1的靶基因不能受到正常誘導(dǎo)，κB抑制蛋白激酶的β亞基的缺失同樣影響到了HIF-1在細菌感染的巨噬細胞中的數(shù)量或表達[22]。這些數(shù)據(jù)表明κB抑制蛋白激酶的β亞基對于低氧反應(yīng)而言，是一個不可或缺的生理因素，它在低氧應(yīng)答與固有免疫及炎癥過程中，發(fā)揮著重要的聯(lián)系作用[23]。另有研究發(fā)現(xiàn)NF-κB可上調(diào)HIF-1α的表達，這提示在對抗感染及組織損傷的過程中，固有免疫應(yīng)答與低氧應(yīng)答之間可能存在相互的依賴[22]。在κB抑制蛋白激酶β亞基基因敲除的動物模型髓源性細胞中，在低氧條件下HIF-1的表達未見增多，提示NF-κB通路的紊亂對于HIF-1的激活存在直接影響[13,16,21]。

6 小結(jié)與展望

上述結(jié)果表明在機體低氧應(yīng)答與固有免疫應(yīng)答之間存在極為密切的聯(lián)系，HIF-1及NF-κB在這兩個過程中發(fā)揮著重要的聯(lián)系及調(diào)節(jié)作用。長時間大強度運動導(dǎo)致機體氧供應(yīng)是公認(rèn)的事實，而受到低氧應(yīng)答調(diào)節(jié)的NF-κB是抗菌肽產(chǎn)生的激活因子,由此以來我們推測運動性低氧對機體抗菌肽表達及固有免疫機能的發(fā)揮均可能存在較為深刻的影響。目前運動免疫學(xué)的熱點集中于運動應(yīng)激對神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)的影響[24]，對上述二者之間的關(guān)系尚缺乏研究報道。該領(lǐng)域研究的逐步開展可能為運動性免疫抑制的機理闡釋提供很多有趣的事實和數(shù)據(jù)。

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