酸性條件下苯酚降解菌的降解特性及動力學分析

王少峰， 石先陽

(安徽大學資源與環(huán)境工程學院，合肥 230601)

苯酚是工業(yè)廢水中常見的一種水溶性有機污染物。含酚廢水的排放會污染水質，造成生物體中蛋白質變性,引起細胞中毒或死亡，破壞水生生態(tài)系統(tǒng)，危害人類健康，被許多國家列為優(yōu)先控制污染物[1]。

含酚廢水的處理主要采用物理法、化學法與生物法。其中生物法因高效、經(jīng)濟且無二次污染而被廣泛應用。目前，含酚廢水的生物處理主要采用好氧生物處理如活性污泥法和厭氧生物處理。但傳統(tǒng)的活性污泥法對酚濃度較大的廢水處理時間較長，成本高。含酚廢水的厭氧處理大多在UASB(upflow anaerobic sludge blanket)反應器中進行[2]。但苯酚對很多微生物的活性特別是產(chǎn)甲烷細菌的活性有強的抑制作用使得UASB啟動周期較長，限制了厭氧法處理苯酚的應用[1]。

通過向含酚廢水生物處理系統(tǒng)中投加高效苯酚降解菌，可提高系統(tǒng)對苯酚的耐受濃度和去除率，從而縮短處理時間。因此如何選育高效降解苯酚的微生物成為研究的熱點之一[3,4]。近年來，多種降解苯酚的微生物得到分離和鑒定，如：根瘤菌(Rhizobia)[5]、酵母菌(YeastTrichosporoncutaneum)[6]、醋酸鈣不動桿菌(A.calcoaceticus)[7,8]、熱帶假絲酵母菌 (Candidatrop-icalisZ-04)[9]、假單胞菌(Pseudonomonassp.)[10]、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)[11]、紅球菌(Rhodococcus)[12]等。但這些篩選出的微生物主要生活在中性，或偏堿的環(huán)境中，且對高濃度的含酚廢水處理效果不夠理想，因而篩選出對苯酚具有更強耐受能力和降解能力的高效菌種，具有廣闊的應用前景。

本文以從土壤中篩選出的一株高效苯酚降解菌為研究對象，針對酸性含酚廢水的特性，研究了影響苯酚生物降解的關鍵因子并采用動力學方法對苯酚的生物降解過程進行了分析，可為酸性含酚廢水的處理提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

1.1.1 富集培養(yǎng)基[11]牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、NaCl 5.0 g、蒸餾水1000 mL，pH值7.2～7.4。

1.1.2 馴化培養(yǎng)基 KH2PO40.5 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.5 g、NH4Cl 1.0 g、NaCl 0.2 g、MnSO40.05 g、FeSO40.05 g、蒸餾水1000 mL,pH值7.2～7.4。

1.1.3 保存培養(yǎng)基 牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、瓊脂15～ 20 g、NaCl 5.0 g、蒸餾水1000 mL，pH值7.2～7.4。

1.2 菌種的馴化和分離

采集土壤樣品，經(jīng)充分振蕩、浸泡、曝氣后，取土壤水溶液5 mL，加入至50 mL苯酚濃度為200 mg/L的無機鹽培養(yǎng)基中，37 ℃連續(xù)振蕩培養(yǎng)48 h后取5%的培養(yǎng)液轉移至苯酚濃度為600 mg/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)72 h后進行轉接，依次提高苯酚濃度至800、1000、1200、1400、1600 mg/L。最后將濃度為1600 mg/L的培養(yǎng)液涂平板，30 ℃恒溫培養(yǎng)直至長出菌落，挑取單菌落，通過平板劃線分離菌株。

1.3 苯酚的降解

將篩選的菌株在富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)至生長對數(shù)期，(OD值為0.6～0.8)，離心得濕菌體[13]，接種于以苯酚為唯一碳源的馴化培養(yǎng)基中(轉速為130 r/min，接種量達到2 g/L)，每隔6 h取樣，研究溫度、pH、初始濃度對菌株降解苯酚的影響。

1.4 分析方法

苯酚濃度測定采用裝備有毛細管柱DB-FFAP(30 mm × 0.25 mm × 0.25 μm)的Agient7890A型氣相色譜儀進行；載氣為氮氣，流速2.8 mL/min；程序升溫，初溫100 ℃，維持1 min；升溫速率20 ℃/min，終溫180 ℃，維持1 min；汽化室溫度250 ℃，分流進樣(10∶1)；FID檢測器溫度300 ℃；氫流量30 mL/min，空氣流量400 mL/min[14]。菌體濃度測定采用光電比濁法和干重法[15]。

1.5 菌株降解苯酚能力的測定

通過定時測定降解實驗培養(yǎng)液中殘留的苯酚濃度計算苯酚降解率，公式如下:

(1)

2 結果與討論

2.1 溫度的影響

圖1 溫度對苯酚降解的影響

圖2 苯酚降解速率的阿侖尼烏斯圖

在初始苯酚濃度為1000 mg/L，pH值為7的條件下，研究溫度對菌株降解苯酚的影響。結果表明(圖1)菌株隨溫度升高其對苯酚的降解效率也會逐漸升高，在35 ℃時達到最大，為70.3%；因溫度影響菌株降解苯酚酶活性，在35 ℃以后，降解效率開始下降。微生物細胞內酶可降低生化反應活化焓從而提高反應速率，而活化能與活化焓大致相等。據(jù)范特霍夫經(jīng)驗規(guī)則可知，反應速率受溫度的影響主要體現(xiàn)在速率常數(shù)k與絕對溫度K的關系上。因此本文基于熱力學原理[16,17]，采用阿侖尼烏斯方程對不同溫度下菌株降解苯酚的效能進行分析，公式如下：

(2)

上式中：Ea為活化能(KJ/mol)，k為不同溫度下的苯酚降解速率(mg/h)，A為前因子，R為理想氣體常數(shù)(8.314 J/mol/K)。以lnk對T-1作圖(圖2)，由直線斜率求出活化能Ea為645.33 KJ/mol，前因子A為34.01。

2.2 pH的影響

圖3 不同初始pH對苯酚平均降解速率和苯酚降解率的影響

在初始苯酚濃度為1000 mg/L、溫度為30 ℃下研究不同pH值對苯酚降解率的作用。細菌的生長狀況受外界環(huán)境中氫離子濃度的影響。由圖3(A)可知，苯酚平均速率隨pH值的升高而增加(pH值4為33.56 mg/h； pH值5為35.90 mg/h)，但pH值進一步升高，平均降解速率開始逐漸降低，pH值為7時為24.58 mg/h。在pH值為10時，苯酚幾乎沒有降解，平均降解速率僅為2.35 mg/h。為了進一步闡述pH值與菌株苯酚降解速率的相互關系，采用公式(3)對此進行分析：

(3)

式中R為苯酚平均降解速率mg/h，Rmax為最大平均降解速率mg/h，KH和KOH均為速率常數(shù)。采用公式(3)對圖3A中的數(shù)據(jù)進行模擬得到KH，KOH和Rmax分別為1.6×10-3，1.54 × 10-8和34.10 mg/h，計算得到最佳pH值為5.69 [(pKOH+ pKH)/2]。同理為了說明pH對苯酚降解效率的影響，采用方程(3)對圖3(B)中的數(shù)據(jù)進行非線性回歸，得到高的相關系數(shù)0.969，表明該模型可以很好的解釋pH與苯酚降解率之間的關系。KH，KOH和Rmax分別為1.5 × 10-3，2.28 × 10-8和83.53 %，通過計算得到最佳pH值為5.74[(pKOH+ pKH)/2]，這進一步表明該菌株在酸性條件下對高濃度的苯酚具有良好的降解效果。

2.3 苯酚初始濃度的影響

在溫度35 ℃、pH值為7，研究不同初始濃度下(600～1600 mg/L)，菌株對苯酚的降解效能。圖4表明，隨初始苯酚濃度的增加，菌株降解苯酚所需時間延長。苯酚初始濃度為600 mg/L 、800 mg/L和1200 mg/L 時，菌株降解苯酚所需時間分別為18 h、24 h和36 h。根據(jù)圖5中的數(shù)據(jù)可以計算得到苯酚的平均降解率。

圖4 不同初始濃度對苯酚去除的影響

圖5 不同初始濃度對苯酚平均降解速率的影響

2.4 苯酚降解動力學分析

為了研究初始苯酚濃度對菌株降解是否存在抑制作用，本文采用Monod結合Haldane模型對此進行分析[18,19]，模型如下：

(4)

(5)

μmax=Y·Vmax

(6)

式中：μx為微生物比生長速率(h-1)；μmax為微生物最大比生長速率(h-1)；Vmax為微生物最大比降解速率；Cs為限制性底物的濃度(mg/L)；Ks為Monod生長半飽和系數(shù)(mg/L); Ki為底物抑制系數(shù)(mg/L)。

由2.3可知，苯酚在不同濃度時對菌體所產(chǎn)生的抑制作用不同。Monod方程適用于第一基質不受抑制的情況，因此低濃度時，對圖6(A)中的數(shù)據(jù)使用非線性最小二乘法，按方程(4)進行擬合，得到動力學參數(shù)為：μmax=0.239 h-1，Ks=48.91 mg/L，因此菌株的生長動力學方程為：

(7)

同時以苯酚濃度和菌體質量濃度作圖，通過計算斜率，可以得到菌株生長系數(shù)Y = 0.455，見圖6(B)，由公式(6)得到菌體的降解動力學方程為：

(8)

圖6 苯酚降解的動力學圖

A—菌株在低濃度下細胞生長動力學；B—菌株在高濃度下的細胞生長動力學；C—菌株在低濃度下的生長系數(shù)；D—菌株在高濃度下的生長系數(shù)。

高濃度時，由于菌體受到底物的抑制作用，因此用Haldane方程來描述菌體的動力學行為。同理，將圖6(C)中的數(shù)據(jù)將按公式(5)，使用非線性最小二乘法進行擬合，得到動力學參數(shù)為：μmax= 0.53 h-1，Ks= 180.1 mg/L，Ki= 306.48 mg/L。因此，菌株的生長動力學方程為：

(9)

同樣以苯酚濃度和菌體質量濃度作圖，通過計算斜率，可以得到菌株生長系數(shù)Y = 0.451，見圖9(D)，由公式(6)得到菌體的降解動力學方程為:

(10)

目前相關研究報道的高效苯酚降解菌株存在耐酚濃度低，降解時間長等缺陷，例如醋酸不動桿菌的最佳降解苯酚的濃度僅為300 mg/L，紅球菌PNAN5在苯酚濃度為188 mg/L～945 mg/L范圍內才能獲得良好的降解效率(80%～100%)[7,11]，假單胞菌PD39降解800 mg/L的苯酚需72 h[20]，本研究所篩選出的菌株可在48 h以內將濃度為1400 mg/L的苯酚降解99%以上，表明該菌株能夠迅速、高效的降解苯酚，且適用于針對酸性含酚廢水。

建立動力學模型能夠進一步描述菌株對苯酚的降解能力，為該菌最終走向實際應用提供一定的理論和實踐基礎。采用Monod方程并結合Haldane方程對苯酚的生物降解過程進行動力力學分析得到低濃度時動力學參數(shù)分別為μmax= 0.239 h-1，Vmax= 1.35 h-1，Ks = 48.91 mg/L；高濃度時，動力學參數(shù)分別為μmax= 0.53 h-1，Vmax= 1.17 h-1，Ks=180.1 mg/L，Ki=306.48 mg/L。動力學參數(shù)值處在文獻報道的范圍之內[13,18,19]，且在高濃度時，μmax較大，進一步證實該菌株有較強的降解苯酚能力。

3 結論

3.1 溫度為35 ℃時菌株降解苯酚的效率最高，活化能Ea為645.33 KJ/mol。pH模型分析表明：pH值為5.69，菌株降解苯酚的最大平均速率達到34.10 mg/h；pH值為5.74時，菌株對苯酚最大降解率達到83.53%。

3.2 初始苯酚濃度在1400 mg/L以下時，菌株經(jīng)48 h可實現(xiàn)對其完全降解；當苯酚濃度為1600 mg/L時，降解效率達到62.5%，其中當苯酚初始濃度為1200 mg/L時，降解速率最大，為31.87 mg/h。

3.3 低濃度時，菌株降解苯酚符合Monod方程模型，經(jīng)擬合得到動力學參數(shù)分別為μmax= 0.239 h-1，Vmax= 1.35 h-1，Ks = 48.91 mg/L；高濃度時，符合Haldane方程，經(jīng)擬合得到動力學參數(shù)分別為μmax= 0.53 h-1，Vmax= 1.17 h-1，Ks=180.1 mg/L，Ki=306.48 mg/L。

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