NOX及細(xì)胞內(nèi)ROS與膠質(zhì)瘤增殖及惡性程度的關(guān)系

由麗娜 姜海東

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)科中常見(jiàn)的原發(fā)性腦內(nèi)腫瘤，發(fā)生率約為顱內(nèi)腫瘤的40%[1]。近年隨著對(duì)顱內(nèi)腫瘤研究的深入，相關(guān)研究指出腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧酶簇(IDO activity clusters，ROS)可作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的重要媒介，其可能在腫瘤細(xì)胞的增殖及凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[2]。NAD(P)H氧化酶(NOX)被認(rèn)為是ROS的來(lái)源物質(zhì)。本文將探討NOX及細(xì)胞中ROS與腦膠質(zhì)瘤增殖及惡性分級(jí)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院2011年1月至2013年1月經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為腦膠質(zhì)瘤患者48例為研究對(duì)象，其中男性27例，女性21例，年齡為3～72歲，平均年齡為(45.6±5.8)歲，病程為2～14個(gè)月，平均病程為(6.8±2.7)個(gè)月。根據(jù)WHO關(guān)于神經(jīng)中樞系統(tǒng)腫瘤的惡性程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將患者分為Ⅰ級(jí)15例，Ⅱ級(jí)16例，Ⅲ級(jí)10例，Ⅳ級(jí)7例。選取同期行腦外傷手術(shù)的20例非腫瘤患者的正常腦組織為對(duì)照組，其中男性12例，女性8例，年齡為3～74歲，平均年齡為(47.8±3.9)歲。上述各組性別、平均年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，具有可比性，且均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 NOX mRNA含量的測(cè)定 采用RT-PCR(購(gòu)于日本TAKAPA公司)測(cè)定各組腦組織中NOX mRNA含量，設(shè)計(jì)針對(duì)人NOX的PCR的探針序列以及熒光檢測(cè)引物，選擇人GAPDH(由美國(guó)BD公司提供)作為測(cè)試的內(nèi)參物，并采用Trizol試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)提取RNA，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。NOX mRNA相對(duì)表達(dá)量=目的基因/內(nèi)參基因。

1.2.2 腦組織ROS含量測(cè)定 采用流式細(xì)胞儀測(cè)定患者腦部組織ROS含量，將樣本組織剪碎后采用D-Hank's試劑液進(jìn)行沖洗，并加入1 mg/mL的DNASeI以及2.5 g/L胰蛋白酶混合液，并在37℃中孵化30～60 min，并在含有小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中終止消化。樣液反復(fù)吹打后過(guò)濾棄上清液，并用D-Hank's試劑洗滌2次，再次離心5 min，去上清液，留置沉淀物，加入DMEM將懸浮液濃度為2×106/mL的細(xì)胞懸液，并于37℃中避光放置，并采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。ROS含量采用相對(duì)熒光強(qiáng)度表示：實(shí)驗(yàn)測(cè)得平均熒光強(qiáng)度/對(duì)照組平均熒光強(qiáng)度。

1.2.3 免疫組化法測(cè)定腦膠質(zhì)瘤組織NOX表達(dá) 將患者腦部組織標(biāo)本切成4～8 μm的冰凍切片，室溫下靜置30 min，加入4°C丙酮固定10 min，用PBS洗滌3次，加入過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物活性，采用PBS洗滌3次，5 min/次，加入兔抗人NOX一抗，并在室溫下孵化2 h后用PBS漂洗，隨后加入1∶500的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，并在室溫下避光孵育30 min，用PBS漂洗，并在熒光顯微鏡下觀察NOX表達(dá)情況。

1.2.4 免疫組化法陽(yáng)性結(jié)果判斷 ①在倍數(shù)為100的顯微鏡下觀察細(xì)胞著色情況，根據(jù)著色程度由輕至重可分別記為0、1、2、3；②隨機(jī)選取5個(gè)視野點(diǎn)，采用倍數(shù)為400的顯微鏡分別對(duì)5個(gè)視野進(jìn)行觀察，每個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞的陽(yáng)性百分比(以500個(gè)細(xì)胞作為1組計(jì)算單位)，細(xì)胞陽(yáng)性百分率：<10%為1分,10%～50%為2分,>50%為3分。積分計(jì)算：①與②計(jì)算所得的分值相乘，積分0分為陰性“-”，1～3分為弱陽(yáng)性“+”，4～6分為中度陽(yáng)性“++”，7～9分為強(qiáng)陽(yáng)性“+++”[3]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測(cè)腦組織NOX mRNA表達(dá)

與正常腦組織相比，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞組織中NOX1～5 mRNA的含量顯著增加，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR檢測(cè)腦組織NOX mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.2 腦膠質(zhì)瘤組織ROS含量測(cè)定

經(jīng)單因素分析，NOX表達(dá)量與ROS的含量呈正相關(guān)(γ=0.698，P=0.001)。隨著腦膠質(zhì)瘤分級(jí)的增加，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞組織中ROS的含量顯著增加，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 NOX在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況

隨著病理分級(jí)水平的增加，NOX表達(dá)陽(yáng)性率顯著增加，兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 流式細(xì)胞儀測(cè)定腦組織ROS含量±s)

表3 免疫組化法檢測(cè)NOX在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況(例，%)

3 討論

相關(guān)研究指出[4]，ROS屬于細(xì)胞內(nèi)部的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，對(duì)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄、增殖、凋亡起到重要的調(diào)控作用。構(gòu)成ROS酶體包括NOX、脂氧化酶、黃嘌呤氧化酶、環(huán)氧合酶、線粒體呼吸鏈以及不偶聯(lián)一氧化氮合酶，其中NOX被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源。

當(dāng)機(jī)體在正常狀態(tài)下，NOX則能保持一定的活性并產(chǎn)生ROS，在正常生理情況下ROS的表達(dá)處在低水平，其生命活性受到抑制。通過(guò)此途徑產(chǎn)生的ROS其生理作用主要是作為第二信使對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)的介質(zhì)如轉(zhuǎn)錄因子、蛋白激酶、蛋白磷酸酶等物質(zhì)產(chǎn)生作用，從而調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)[5]。同時(shí)ROS還能參與到多器官的生理功能調(diào)控中，對(duì)維持機(jī)體正常的生命活動(dòng)起到重要的作用。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)會(huì)激活NOX產(chǎn)生大量的ROS，從而誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)各種疾病[6]。研究表明[7]，腦組織中ROS主要參與到腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中，當(dāng)細(xì)胞中ROS濃度過(guò)高時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA出現(xiàn)損傷，從而導(dǎo)致DNA出現(xiàn)突變，引發(fā)腫瘤的產(chǎn)生；此外高濃度的ROS會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)異常增殖，并能誘導(dǎo)低氧因子以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子產(chǎn)生，從而導(dǎo)致腫瘤血管增生，促使腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，48例腦膠質(zhì)瘤組織樣本中均能檢出NOX及ROS有不同程度的表達(dá)，而在正常的腦組織中NOX及ROS的表達(dá)則較低。在不同病理級(jí)別的膠質(zhì)瘤中NOX表達(dá)存在差異性，隨著惡性程度的增高，患者中NOX以及ROS的表達(dá)也隨之增高。且NOX1～5 mRNA的表達(dá)量隨著腫瘤級(jí)別的增加而顯著增加，并且ROS也隨之增加。NOX是產(chǎn)生ROS的主要酶體，并且與腦膠質(zhì)瘤的惡性分級(jí)有密切關(guān)系。免疫組化法檢測(cè)NOX在腦部組織的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)隨著病理分級(jí)水平的增加，NOX表達(dá)陽(yáng)性率顯著增加，從而進(jìn)一步提示，NOX在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展過(guò)程中起到重要的作用。

目前對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的治療效果并不理想，傳統(tǒng)的放化療以及手術(shù)治療后容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)，這可能與NOX表達(dá)的上調(diào)以及產(chǎn)生的ROS調(diào)控腦膠質(zhì)瘤基因表達(dá)、增殖以及凋亡有密切關(guān)系[8]。本研究也證實(shí)了在腦膠質(zhì)瘤中NOX具有較高的表達(dá)能力，經(jīng)單因素分析，NOX表達(dá)量與ROS的含量呈正相關(guān)(γ=0.698，P=0.001)，其原因可能與NADPH氧化酶DPI抑制NOX活性，進(jìn)而清除細(xì)胞內(nèi)ROS，減少腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)，因此通過(guò)抑制NOX的產(chǎn)生可作為治療腦膠質(zhì)瘤的新型治療手段。但對(duì)于NOX在腦膠質(zhì)瘤中的具體表達(dá)機(jī)制、活性調(diào)控機(jī)制以及亞單位結(jié)構(gòu)的相互作用還需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。

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