叢枝菌根真菌最新分類系統(tǒng)與物種多樣性研究概況

王宇濤，辛國(guó)榮，李韶山，*

(1.廣東省高等學(xué)校生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631;2.生物防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510275)

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)是地球上分布最廣泛的一類植物共生真菌，能夠與大部分高等植物的根系形成共生關(guān)系［1］。它們也是一類非常古老、起源和演化相對(duì)獨(dú)立的微生物;化石證據(jù)表明，最早的AMF起源于大約4.6億年之前，幾乎與陸生植物同時(shí)出現(xiàn)在地球上，是植物從水生環(huán)境成功登陸的兩個(gè)伴生物種之一［2］。由于AMF在農(nóng)林、環(huán)境等領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛力，AMF物種多樣性的研究一直受到較高的關(guān)注。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，AMF能夠通過(guò)直接和間接作用對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中植物群落的多樣性和生產(chǎn)力產(chǎn)生深刻影響［3］;因此，AMF物種多樣性的研究愈發(fā)顯得重要。不過(guò)，由于AMF只有與活體寄主植物的根系形成共生關(guān)系之后才能完成其生活史，極大增加了對(duì)其分類以及多樣性研究的難度;再加上研究手段及其它因素的限制，阻礙了AMF物種多樣性的研究進(jìn)展。近年來(lái)，研究方法的改進(jìn)與新技術(shù)的發(fā)展為AMF物種多樣性的研究提供了極好的機(jī)遇。本文綜述了近年來(lái)在AMF分類系統(tǒng)和全球物種數(shù)量、AMF物種多樣性影響因素以及AMF物種多樣性研究方法3個(gè)方面的最新研究進(jìn)展，以期為國(guó)內(nèi)同行提供參考。

1 AMF的分類系統(tǒng)及全球物種數(shù)量

1.1 AMF的最新分類系統(tǒng)

AMF分類系統(tǒng)的建立是開(kāi)展AMF物種多樣性研究重要的基礎(chǔ)性工作。早期AMF的分類研究嚴(yán)重依賴于對(duì)AMF形態(tài)特征的觀察。Morton等［4］依據(jù)對(duì)27類AMF結(jié)構(gòu)特征(包括AMF孢子及根內(nèi)的形態(tài))的綜合分析，將全部AMF歸入新設(shè)立的球囊霉目(Glomerales，隸屬于接合菌綱)。Schüβler等［5］依據(jù)對(duì)18S rDNA分子進(jìn)化分析的結(jié)果，將AMF的分類地位提升至門(mén)，并歸入新設(shè)立的球囊霉門(mén)(Glomeromycota，包括所有已知AMF種類及一種目前所知甚少的內(nèi)生真菌(Geosiphon pyriforme))。剛設(shè)立時(shí)球囊霉門(mén)［5］包含1個(gè)綱(Glomeromycetes)4 個(gè)目(Glomerales，Diversisporales，Paraglomerales，Archaeosporales)7個(gè)科(Glomeraceae，Gigasporaceae，Acaulosporaceae，Diversisporaceae，Paraglomeraceae，Archaeosporaceae，Geosiphonaceae)9 個(gè)屬(Glomus， Gigaspora， Scutellospora， Acaulospora， Entrophospora， Diversispora， Paraglomus， Archaeospora，Geosiphon);此后經(jīng)過(guò)不斷補(bǔ)充和調(diào)整［6］又新增了 4個(gè)科(Claroideoglomeraceae，Entrophosporaceae，Pacisporaceae，Ambisporaceae)9 個(gè) 屬 (Funneliformis，Rhizophagus，Sclerocystis，Claroideoglomus，Racocetra，Pacispora，Otospora，Redeckera，Ambispora)，使AMF(球囊霉門(mén))分類系統(tǒng)包含了1個(gè)綱4個(gè)目11個(gè)科18個(gè)屬(見(jiàn) http://www.amf－phylogeny.com)。最近，Oehl等［7］根據(jù)對(duì) AMF 的 DNA 序列(包括 rDNA 和 β－微管蛋白基因序列)以及形態(tài)學(xué)特征的綜合分析，進(jìn)一步對(duì)球囊霉門(mén)分類系統(tǒng)進(jìn)行了調(diào)整，形成目前包含3個(gè)綱5個(gè)目14個(gè)科26個(gè)屬的最新AMF分類系統(tǒng)(表1)［7］。

表1 叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi(AMF)，球囊霉門(mén))最新的分類系統(tǒng)［7］Table 1 Updated classification system of arbuscular mycorrhizal fungi(AMF，Glomeromycota)［7］

1.2 AMF的全球物種數(shù)量

地球上大約有70%—80%的高等植物種類能夠與AMF形成共生關(guān)系［1］。到目前為止，在從熱帶雨林到極地冰原絕大多數(shù)類型的生境中均發(fā)現(xiàn)了 AMF的存在［8］。大量研究分別報(bào)道了森林［9］、草原［10］、農(nóng)田［11］、高原［12－13］、高山草甸［14］、沙漠［15］、干熱河谷［16］、鹽堿地［17］、工業(yè)污染區(qū)［18］、濱海紅樹(shù)林［19－20］等生態(tài)系統(tǒng)中AMF與寄主植物的共生關(guān)系。AMF豐富的寄主和生境多樣性充分證明它們對(duì)不同生境類型的適應(yīng)性，以及它們對(duì)部分脅迫環(huán)境的耐受能力。

盡管AMF具有極高的寄主和生境類型多樣性，迄今為止全球范圍內(nèi)報(bào)道的AMF物種數(shù)量要少于250個(gè)種(http://www.amf－phylogeny.com)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其寄主植物的種類多樣性。一個(gè)通常的解釋是AMF具有較低的寄主偏好性和專一性;不少研究的結(jié)果在一定程度上支持了這一觀點(diǎn)［10，21］。然而也有明確的證據(jù)顯示，至少部分AMF種類與寄主植物之間存在著明顯的寄主偏好性［22］;還有報(bào)道稱，AMF在寄主植物根內(nèi)的生長(zhǎng)模式［23］以及它們對(duì)寄主植物的生態(tài)效應(yīng)［24］與兩者的種類(株系)密切相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了AMF寄主專一性和偏好性的存在。因此，用AMF較低的寄主偏好性和專一性來(lái)解釋AMF種類多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其寄主的種類多樣性目前還存在較大的爭(zhēng)議。

近年來(lái)，有越來(lái)越多的證據(jù)表明AMF在全球的種類數(shù)量可能被嚴(yán)重低估［20，25］。B?rstler等［14］根據(jù)在兩個(gè)高山草甸生態(tài)系統(tǒng)中AMF的多樣性調(diào)查結(jié)果推測(cè)，全球范圍內(nèi)AMF種類至少要超過(guò)1250種。?pik等［26］采用整合分析的方法探討了AMF在全球的群落多樣性，發(fā)現(xiàn)在已調(diào)查的52種寄主植物根內(nèi)一共定殖有95個(gè)AMF的分類單元。Wang等［20］甚至在高鹽、高濕的濱海紅樹(shù)林生境中也檢測(cè)到很高的AMF物種多樣性:他們從在不同潮間帶均有分布的3種寄主植物根內(nèi)一共檢測(cè)到23個(gè)AMF分類單元。還有不少調(diào)查試驗(yàn)的結(jié)果［27－31］也表明，在許多類型的生態(tài)系統(tǒng)中都存在較高的AMF種類多樣性(表2);尤其是在運(yùn)用分子學(xué)手段進(jìn)行AMF物種多樣性的調(diào)查當(dāng)中，往往出現(xiàn)較大比例未知種類的AMF序列［3，20，25］;這些結(jié)果進(jìn)一步支持了AMF在全球范圍內(nèi)的物種多樣樣可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)目前所發(fā)現(xiàn)種類的觀點(diǎn)。有學(xué)者甚至提出，全球范圍內(nèi)AMF的種類多樣性可能與其寄主植物種類的多樣性處于一個(gè)相當(dāng)?shù)乃剑?，32］。盡管AMF在全球范圍內(nèi)的物種多樣性水平還需要進(jìn)一步的研究才能明確，AMF的物種多樣性很可能要遠(yuǎn)高于目前所發(fā)現(xiàn)的AMF種類。

表2 檢測(cè)到較高叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)物種數(shù)量的典型研究Table 2 Typical reports in which high level of arbuscular mycorrhizal fungi(AMF)species richness were detected

2 AMF物種多樣性的影響因素

在生態(tài)系統(tǒng)中能夠影響AMF物種多樣性的因素很多;每一處生境中AMF的物種多樣性及其分布特征都是由各種生物和非生物因素共同作用的結(jié)果。

2.1 寄主植物

作為生活在植物根內(nèi)的專性共生真菌，AMF的物種多樣性水平受到寄主植物的影響是顯而易見(jiàn)的。由于不同植物在生理代謝、根系形態(tài)結(jié)構(gòu)與分泌物等方面可以存在較大差異，這必然會(huì)影響到AMF對(duì)寄主植物的識(shí)別和感染，進(jìn)而影響到AMF的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)孢、分布、群落組成、多樣性等［33］。

到目前為止，關(guān)于寄主植物對(duì)AMF物種多樣性影響的研究通常都是在植物種的水平進(jìn)行的探討。不少研究發(fā)現(xiàn)，在相同或者類似的生境中，不同種類寄主植物根內(nèi)或根際的AMF物種多樣性通常存在較大的差異［34］，證實(shí)了寄主植物種類對(duì)AMF物種多樣性的重要影響。然而，也有研究發(fā)現(xiàn)植物種類對(duì)AMF多樣性并無(wú)明顯影響［32］。因此，寄主種類對(duì)AMF物種多樣性的影響應(yīng)該是與特定的生境、植物種類以及AMF類型密切相關(guān)的［20］。在植物種以下水平，關(guān)于不同品種(基因型)寄主植物對(duì)AMF物種多樣性影響的研究則尚不多見(jiàn)。郭紹霞和劉潤(rùn)進(jìn)［35］調(diào)查了同一生境不同牡丹(Paeonia suffruticosa)品種根際土壤中AMF孢子的密度、種屬組成、物種多樣性指數(shù)等，發(fā)現(xiàn)不同品種的牡丹能促進(jìn)或抑制不同AMF種類的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而影響根際AMF的多樣性和群落特征。Hannula等［36］采用末端限制性長(zhǎng)度多態(tài)性(T－RFLP)的方法監(jiān)測(cè)了大田控制試驗(yàn)中六個(gè)不同土豆(Solanum tuberosum)品種根圍AMF的群落結(jié)構(gòu)及多樣性，發(fā)現(xiàn)寄主品種的差異對(duì)根圍AMF的多樣性和群落結(jié)構(gòu)并無(wú)明顯的影響。因此，不同品種或基因型的植物對(duì)AMF物種多樣性是否存在影響、影響的強(qiáng)度及影響機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究才能明確。近年來(lái)，在群落水平研究寄主植物對(duì)AMF物種多樣性的影響成為菌根領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注的課題。由于不同種類的寄主植物對(duì)AMF的偏好性、專一性及作用方式通常存在較大差異，植物的群落結(jié)構(gòu)及多樣性必然會(huì)對(duì)該生境中AMF的種類組成和物種多樣性產(chǎn)生深刻的影響。不少研究發(fā)現(xiàn)，在植物多樣性高的生境中AMF的物種多樣性水平往往也較高［9，16］;因此，寄主植物的群落多樣性可能是決定AMF物種多樣性的重要因素［33，37－38］。然而，對(duì)于這一結(jié)果也可以有不同的解釋，即AMF的物種多樣性可能也是影響植物群落多樣性的一個(gè)重要因子［39］。事實(shí)上，AMF的物種多樣性和植物群落多樣性應(yīng)該是一種相互影響、相互作用的關(guān)系［3］。

2.2 環(huán)境因子

環(huán)境因子對(duì)AMF物種多樣性的影響一直是菌根研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。在影響AMF多樣性的各種環(huán)境因素當(dāng)中，報(bào)道得最多的是土壤狀況對(duì)AMF物種多樣性的影響。迄今為止，關(guān)于土壤理化因子對(duì)土壤中AMF孢子種類組成影響的研究已經(jīng)很多報(bào)道［34］。Oehl等［40］調(diào)查了16個(gè)不同生態(tài)樣區(qū)土壤中AMF孢子的種類組成及多樣性，發(fā)現(xiàn)土壤類型能強(qiáng)烈影響AMF孢子的群落結(jié)構(gòu)及多樣性水平。Antoninka等［41］在一處草地生態(tài)系統(tǒng)中開(kāi)展的研究表明，長(zhǎng)期(7a)施用N肥能顯著降土壤中AMF孢子的密度及種類多樣性。Gosling等［42］的研究發(fā)現(xiàn)，向農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中添加適量有機(jī)質(zhì)能夠明顯提高農(nóng)田土壤中AMF孢子種類的多樣性。此外，關(guān)于土壤理化因子對(duì)寄主根內(nèi)AMF物種多樣性影響的研究也有部分報(bào)道。Wirsel［43］采用分子學(xué)方法調(diào)查了一處濕地生態(tài)系統(tǒng)中分布在不同類型土壤中的蘆葦(Phragmites australis)根內(nèi)AMF感染強(qiáng)度和物種多樣性，發(fā)現(xiàn)寄主植物根圍土壤的理化特征是蘆葦根內(nèi)AMF感染強(qiáng)度和多樣性的決定性因子。van Diepen等［44］在一處硬木森林中開(kāi)展的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期(＞12a)施用外源N能夠強(qiáng)烈影響該生境中AMF的群落結(jié)構(gòu)，并顯著降低寄主植物根內(nèi) AMF 的物種多樣性。Zarei等［45］和 Martínez－García等［15］的研究也都表明，土壤理化因子是影響寄主植物根內(nèi)以及根際AMF的群落結(jié)構(gòu)和多樣性的重要影響因素。因此，土壤性狀無(wú)論是對(duì)于根際AMF孢子群落還是根內(nèi)AMF種類的多樣性水平均具有重要的影響。

除了土壤理化因子之外，還有不少研究報(bào)道了其它環(huán)境因素對(duì)AMF物種多樣性的影響。Wang等［20］采用分子學(xué)手段調(diào)查了一處紅樹(shù)林濕地生態(tài)系統(tǒng)中的AMF多樣性，發(fā)現(xiàn)淹水強(qiáng)度是影響濕地植物根內(nèi)AMF多樣性的決定性因子。Gai等［46］調(diào)查了西藏色拉山在不同海拔分布的寄主植物與AMF的共生狀況，發(fā)現(xiàn)隨著海拔的增加，AMF的感染強(qiáng)度、根際土壤中的孢子密度及種類多樣性均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。Wu等［47］調(diào)查了富士山在不同海拔高度均有分布的四種寄主植物根內(nèi)以及根際的AMF物種多樣性，發(fā)現(xiàn)AMF的物種多樣性水平呈現(xiàn)隨海拔升高而下降的規(guī)律;他們認(rèn)為，這可能是由不同海拔高度的植物群落結(jié)構(gòu)、土壤理化性質(zhì)存在差異所導(dǎo)致的。還有研究發(fā)現(xiàn)，季節(jié)變化對(duì)寄主植物根內(nèi)AMF的物種多樣性具有顯著的影響［9－10］;Dumbrell等［31］運(yùn)用最新的焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了一處溫帶草原生境中部分寄主植物根內(nèi)的AMF群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)寄主根內(nèi)AMF的物種多樣性及群落組成在冬季和夏季存在明顯的差異。季節(jié)變化對(duì)AMF多樣性的影響主要是由于寄主植物根系的物候?qū)W特征、寄主植物以及AMF孢子的周邊環(huán)境因子(如溫度、日照時(shí)間、水分等)等隨季節(jié)變化而引起的［9－10，31］。近年來(lái)，關(guān)于全球氣候變化(如氣溫增加、大氣CO2濃度升高等)對(duì)AMF多樣性影響的研究受到關(guān)注。不少研究表明，在一定范圍內(nèi)CO2濃度的升高能夠促進(jìn)寄主植物的光合作用，增加碳水化合物向地下部的供應(yīng)［48］，進(jìn)而提高根際AMF的侵染強(qiáng)度和物種多樣性［41，49］。還有研究發(fā)現(xiàn)，溫度升高同樣能夠增加寄主植物根圍AMF的侵染強(qiáng)度和物種多樣性［50］;一方面是由于溫度升高直接促進(jìn)了AMF根外菌絲的分枝與伸長(zhǎng)［51］，另一方面則是由于溫度升高促進(jìn)了寄主植物的光合作用［49，51］。不過(guò)也有報(bào)道稱，溫度升高能夠提高土壤中N、P營(yíng)養(yǎng)的有效性［52－53］，進(jìn)而減少寄主根圍AMF的物種多樣性?？傮w上，關(guān)于全球氣候變化對(duì)AMF物種多樣性的影響尚未闡明;通過(guò)較大的時(shí)間和空間尺度來(lái)探討全球氣候變化對(duì)AMF物種多樣性的影響，將是今后AMF物種多樣性研究領(lǐng)域值得關(guān)注的研究方向。

2.3 人類活動(dòng)

人類活動(dòng)能夠通過(guò)直接或者間接的方式對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中AMF的物種多樣性產(chǎn)生深刻的影響。有研究報(bào)道，人類活動(dòng)的干擾會(huì)顯著降低生態(tài)系統(tǒng)中AMF的物種多樣性［54］。Helgason等［55］的研究結(jié)果表明，在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，人為干擾程度大的農(nóng)田中AMF的物種多樣性水平通常較低。Lin等［56］利用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)測(cè)定了華北地區(qū)長(zhǎng)期(＞20a)采用不同施肥方式的農(nóng)田中AMF的多樣性及群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施肥處理(尤其是施用P肥和N肥)明顯降低了農(nóng)田生境中的AMF多樣性水平。Schnoor等［57］在一處半人工草地生態(tài)系統(tǒng)中的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)土壤進(jìn)行機(jī)械翻耕強(qiáng)烈影響了該生境中AMF的群落結(jié)構(gòu)，并顯著降低了AMF的物種多樣性。Daniell等［58］和Rosendahl等［59］的研究結(jié)果也表明，頻繁的人為干擾對(duì)寄主植物根內(nèi)AMF的多樣性和群落結(jié)構(gòu)均存在巨大影響。然而，關(guān)于人為干擾對(duì)AMF多樣性的影響也有不同的報(bào)道。?pik等［29］采用分子學(xué)手段調(diào)查了一處針葉林生境中5種寄主植物根內(nèi)AMF的群落結(jié)構(gòu)和多樣性，發(fā)現(xiàn)一定強(qiáng)度的人為擾動(dòng)對(duì)寄主根內(nèi)AMF的群落結(jié)構(gòu)和多樣性均無(wú)明顯的影響。Hijri等［60］和Vallino等［61］也報(bào)道了類似的結(jié)果。顯然，人類活動(dòng)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)中AMF物種多樣性的影響應(yīng)該是與人為干擾的方式和強(qiáng)度密切相關(guān)的。

3 AMF物種多樣性的研究方法

傳統(tǒng)對(duì)AMF物種多樣性的調(diào)查是基于寄主植物根際土壤中AMF孢子的形態(tài)學(xué)鑒定，包括直接從寄主根際分離或者是利用菌根敏感型植物誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的AMF孢子［1］。迄今為止報(bào)道的AMF種類均是基于該方法鑒定和發(fā)現(xiàn)的。然而，隨著對(duì)AMF多樣性研究的深入，形態(tài)學(xué)方法逐漸暴露出以下不足。一方面，根際土壤中的AMF孢子無(wú)法準(zhǔn)確反映寄主根內(nèi)AMF的群落結(jié)構(gòu)，因而無(wú)法對(duì)植物根內(nèi)的AMF群落動(dòng)態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。由于AMF存在部分不產(chǎn)孢子的種類，基于根際土壤中AMF孢子的多樣性結(jié)果往往低估了AMF真實(shí)的多樣性水平。此外，土壤中還存在一些取食AMF孢子的生物類群［62］以及以AMF孢子為寄主的寄生生物［63］，導(dǎo)致土壤中AMF孢子群落組成與寄主根內(nèi)的AMF種類組成存在較大差異。另一方面，土壤中AMF孢子的群落結(jié)構(gòu)及多樣性水平的調(diào)查結(jié)果強(qiáng)烈受到采樣時(shí)間的影響。Tian等［64］調(diào)查了我國(guó)華北農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中AMF孢子的群落動(dòng)態(tài)，發(fā)現(xiàn)AMF孢子的種類組成及多樣性水平明顯受到種植作物(小麥，Triticum aestivum)生長(zhǎng)發(fā)育期的影響:AMF孢子的種類多樣性在植物需P量高的生長(zhǎng)期要明顯高于其它時(shí)期。Li等［65］和Cuenca等［66］的研究結(jié)果也表明，采樣時(shí)間對(duì)AMF孢子多樣性的調(diào)查結(jié)果具有重要的影響。最后，AMF孢子的形態(tài)學(xué)鑒定在很大程度上依賴于研究人員的經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)資料的獲取，對(duì)于初學(xué)者往往具有較大的難度;以形態(tài)特征為依據(jù)的AMF鑒定方法在一定程度上具有不一致性、偶然性和局限性［16］。

自Simon等［67］首次運(yùn)用分子學(xué)技術(shù)調(diào)查寄主根內(nèi)AMF的多樣性以來(lái)，以PCR為基礎(chǔ)的分子學(xué)方法已廣泛應(yīng)用于AMF的種類鑒定、多樣性調(diào)查以及群落結(jié)構(gòu)的研究。一般情況下，該方法首先對(duì)AMF的核糖體小亞基基因、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)及/或核糖體大亞基基因片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，然后運(yùn)用變性梯度凝膠電泳［68］、單鏈構(gòu)象多態(tài)性［69］、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性［70］或者末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性［71］等技術(shù)對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行初步的分型分析，最后測(cè)定目的片段的DNA序列，并開(kāi)展分子系統(tǒng)發(fā)育分析。相比基于AMF孢子形態(tài)學(xué)鑒定的傳統(tǒng)手段，分子學(xué)方法最大的優(yōu)點(diǎn)在于能夠直接檢測(cè)寄主根內(nèi)的AMF群落結(jié)構(gòu)和多樣性;并且其實(shí)驗(yàn)操作更為標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果也更為可信［72］。因此，它們的運(yùn)用極大拓展了對(duì)不同生境中AMF物種多樣性的認(rèn)識(shí)，加深了對(duì)AMF物種多樣性的理解。

另一方面，盡管分子學(xué)技術(shù)較好的彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法的缺陷，它們?cè)趹?yīng)用于AMF物種多樣性的研究中同樣面臨不少問(wèn)題。首先，盡管目前已經(jīng)報(bào)道了不少用于AMF序列特異性擴(kuò)增的引物(例如，AM1－NS31［55］，AML1－AML2［73］)，這些引物大多只能擴(kuò)增部分的已知 AMF 種類［74］，導(dǎo)致分子學(xué)調(diào)查的結(jié)果無(wú)法全面反映目標(biāo)寄主根內(nèi)的AMF多樣性。其次，盡管技術(shù)上的改進(jìn)已經(jīng)降低了Sanger測(cè)序的成本，在樣本量較大的情況下AMF多樣性的分子學(xué)調(diào)查仍然價(jià)格不菲。因此，在運(yùn)用分子學(xué)技術(shù)對(duì)寄主植物根內(nèi)的AMF多樣性進(jìn)行調(diào)查時(shí)往往只能選取生境中少數(shù)代表性的植物種類進(jìn)行檢測(cè)［26］，難以全面反映寄主植物根內(nèi)的AMF多樣性。最后，AMF多樣性的分子學(xué)研究最終獲得的是AMF的種系型或者分類單元，而不是傳統(tǒng)意義上的AMF“種”。由于目前對(duì)于AMF種間和種內(nèi)的基因差異水平尚不清楚［75］，用于AMF分子進(jìn)化分析的目標(biāo)片段通常也無(wú)法在種的水平鑒別AMF［74］，導(dǎo)致分子學(xué)研究中獲得的AMF種系型/分類單元難以同傳統(tǒng)意義上的AMF“種”建立明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系。以上問(wèn)題的存在一定程度上限制了分子學(xué)方法的應(yīng)用，阻礙了AMF物種多樣性的研究進(jìn)展。最近，運(yùn)用分子學(xué)方法研究AMF的物種多樣性取得了明顯的進(jìn)展。Krüger等［74］設(shè)計(jì)出4組AMF特異性的引物混合物，其目的片段所包含的變異位點(diǎn)具備在種的水平區(qū)分AMF的能力，被推薦作為AMF的DNA條形碼(DNA barcoding)［76－77］。Wang等［20］首次報(bào)道了該組引物應(yīng)用于野外AMF多樣性調(diào)查的研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)除了其擴(kuò)增片段具有足夠的變異位點(diǎn)之外，該組引物具有很高的AMF特異性。如果在今后的研究當(dāng)中能夠進(jìn)一步確認(rèn)該序列作為DNA條形碼的可行性，無(wú)疑能夠極大的推進(jìn)對(duì)AMF物種多樣性的研究進(jìn)展。

AMF物種多樣性的研究進(jìn)展在很大程度上依賴于研究手段的不斷進(jìn)步。近年來(lái)快速發(fā)展的新一代測(cè)序技術(shù)，如最新的454焦磷酸測(cè)序技術(shù)(454 pyrosequencing)，在對(duì)AMF物種多樣性的研究當(dāng)中具備了傳統(tǒng)分子學(xué)方法無(wú)可比擬的巨大優(yōu)勢(shì)。首先，新一代測(cè)序技術(shù)的測(cè)序深度在數(shù)量級(jí)上遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于第一代測(cè)序技術(shù)，可以檢測(cè)到極微量的AMF序列，便于發(fā)現(xiàn)寄主根內(nèi)非優(yōu)勢(shì)的AMF種類。其次，新一代測(cè)序技術(shù)在對(duì)AMF特定的DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增之后直接進(jìn)行測(cè)序，無(wú)需對(duì)目的片段進(jìn)行克隆、分型分析等操作，其研究結(jié)果相對(duì)來(lái)講更接近目標(biāo)生境中AMF真實(shí)的群落結(jié)構(gòu)。目前，國(guó)際上有研究已經(jīng)報(bào)道了運(yùn)用該技術(shù)對(duì)AMF多樣性的調(diào)查結(jié)果。?pik等［25］首次報(bào)道了運(yùn)用該技術(shù)對(duì)一處自然生境中AMF多樣性的調(diào)查結(jié)果，發(fā)現(xiàn)454焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以檢測(cè)到部分傳統(tǒng)分子學(xué)方法無(wú)法檢測(cè)到的AMF分類單元。Dumbrell等［31］和Gillevet等［78］也報(bào)道了類似的研究結(jié)果。Moora等［30］運(yùn)用454測(cè)序技術(shù)調(diào)查了分布于不同地區(qū)棕櫚樹(shù)(Trachycarpus fortunei)根內(nèi)的AMF群落結(jié)構(gòu);他們從14處棕櫚樹(shù)分布生境(包括4處自然分布的生境以及10處移栽的生境)的目標(biāo)寄主根內(nèi)一共檢測(cè)到73個(gè)AMF分類單元。這些報(bào)道不僅充分證明了新一代測(cè)序技術(shù)在AMF物種多樣性研究中的巨大應(yīng)用前景，也在一定程度上支持了全球的AMF物種多樣性水平被嚴(yán)重低估的觀點(diǎn)。隨著近年來(lái)454焦磷酸測(cè)序技術(shù)在序列可讀長(zhǎng)度(目前可達(dá)到700—1000 bp)以及成本控制方面的快速發(fā)展，可以預(yù)見(jiàn)在數(shù)年之內(nèi)該技術(shù)將極大的加深人們對(duì)AMF物種多樣性的理解。

4 展望

研究方法的改進(jìn)與新技術(shù)的發(fā)展為目前AMF物種多樣性的研究提供了極好的機(jī)遇;有理由相信，AMF物種多樣性的研究將在幾年之內(nèi)取得較大的進(jìn)展。除了新技術(shù)的發(fā)展值得期待之外，筆者認(rèn)為在AMF物種多樣性研究當(dāng)中有以下兩個(gè)方向是需要重點(diǎn)關(guān)注的。首先，加強(qiáng)對(duì)不同類型生境(尤其是各種特殊的生境類型)中AMF的物種多樣性及其生態(tài)功能的研究，并深入探討AMF的種類組成或多樣性水平與它們?cè)谏鷳B(tài)系統(tǒng)中所發(fā)揮的生態(tài)功能之間的聯(lián)系。例如，盡管已經(jīng)有明確的證據(jù)顯示濕地生態(tài)系統(tǒng)中也廣泛存在AMF與植物的共生［19－20，43］，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于各種類型濕地生態(tài)系統(tǒng)中AMF的物種多樣性水平以及AMF在濕地生境中的生態(tài)功能還所知甚少。其次，結(jié)合常規(guī)研究方法以及最新的技術(shù)手段，通過(guò)構(gòu)建大型永久樣地或者開(kāi)展大尺度(包括時(shí)間和空間跨度)調(diào)查試驗(yàn)的方式系統(tǒng)的研究AMF物種多樣性對(duì)生境中其它土壤微生物、動(dòng)物以及植物群落特征的影響機(jī)制，以深入理解AMF群落對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)(乃至全球生態(tài)系統(tǒng))的影響及作用機(jī)制。

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