CircSERPINE2 靶向miR-23a-3p 調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的分子機(jī)制

胡穎婷 鄒毅剛 周外平（武漢市第四醫(yī)院疼痛科，武漢 430030）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種常見(jiàn)的全身性和自身免疫性疾病，滑膜成纖維細(xì)胞（culture synovial fibroblasts，F(xiàn)LSs）的異樣增生是導(dǎo)致其發(fā)生發(fā)展的重要原因，在RA 病程中，滑膜轉(zhuǎn)變?yōu)樵錾那忠u性組織，導(dǎo)致軟骨和骨骼的破壞；因此研究其具體分子機(jī)制，可為確定未來(lái)治療靶點(diǎn)提供依據(jù)和參考［1-3］。非編碼RNA（ncRNA）主要包括microRNA（miRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）等，可作為診斷和治療RA 的生物標(biāo)志物［4］。研究報(bào)道骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中CircSERPINE2 表達(dá)降低與細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度凋亡及合成代謝、分解代謝因子之間的失衡直接相關(guān)，CircSERPINE2 過(guò)表達(dá)可通過(guò)miR-1271-ERG 途徑減輕軟骨凋亡并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成代謝［5］。CircSERPINE2 上調(diào)表達(dá)可促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖［6］。而CircSERPINE2 對(duì)RA 滑膜成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道m(xù)iR-23a-3p 通過(guò)直接靶向軟骨細(xì)胞中的SMAD3 促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展［7］。白藜蘆醇可通過(guò)調(diào)控SIRT1/NF-κB/miR-23a-3p/cul3激活SIRT1-Nrf2 信號(hào)通路，從而改善RA［8］。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究CircSERPINE2 對(duì)RA 滑膜成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的影響及機(jī)制是否與miR-23a-3p有關(guān)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取于武漢市第四醫(yī)院就診的44例RA患者，RA的診斷根據(jù)1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂標(biāo)準(zhǔn)；于清晨空腹抽取其外周血20 ml，同時(shí)取44 例同期健康體檢者外周血作為對(duì)照。倫理審批號(hào)：KY2022-077-01。

1.1.2 細(xì)胞與主要試劑 人原代滑膜成纖維細(xì)胞（SFs）和人原代RA 滑膜成纖維細(xì)胞（RA-FLSs）購(gòu)自美國(guó)ATCC；RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco；血漿RNA 提取試劑盒購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；Trizol 試劑、熒光定量試劑盒購(gòu)自大連寶生物；RIPA蛋白裂解液、CCK-8 購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝博生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞處理與分組 采用RPMI1640 培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)FLSs和RA-FLSs，將CircSERPINE2過(guò)表達(dá)載體及陰性對(duì)照、miR-23a-3p 抑制劑及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染 至RA-FLSs 中，記 為pcDNA-CircSERPINE2 組、pcDNA 組、anti-miR-23a-3p 組、anti-miR-NC 組，常規(guī)培養(yǎng)的RA-FLSs 作 為NC 組；將miR-23a-3p 過(guò)表達(dá)載體及陰性對(duì)照分別與CircSERPINE2 過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至RA-FLSs 中，記為miR-23a-3p+pcDNA-Circ-SERPINE2組、miR-NC+pcDNA-CircSERPINE2組。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)Circ-SERPINE2 和miR-23a-3p 表達(dá)水平 提取血漿RNA、FLSs及各組RA-FLSs的總RNA，合成cDNA 后進(jìn)行PCR，用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。以GAPDH和U6 為內(nèi)參。引物序列（5′-3′）CircSERPINE2 F：

GTGCTCACCAGACTGGT，R：TTCACAATCTGATTGAAAAC；GADPH F：AGCCACATCGCTCAGACAC，R：GCCCAATACGACCAAATCC；miR-23a-3p F：CCTTTAGGGACCGTTACACTA，R：TAGTGTAACGGTCCCTAAAGG；U6 F：CTCGCTTCGGCAGCACATA，R：CAGTGCAGGGTCCGAGGTA。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉后，分別加入1∶1 000稀釋的MMP2、MMP9和β-actin一抗4 ℃孵育過(guò)夜，再用1∶2 000稀釋的二抗室溫孵育2 h，發(fā)光液顯影，分析蛋白條帶的相對(duì)灰度值。

1.2.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞活性

各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，更換為含10%CCK-8 培養(yǎng)液，酶標(biāo)儀檢測(cè)孵育2 h后450 nm吸光度值（A）。

1.2.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲數(shù) 用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸各組細(xì)胞，取200 μl 細(xì)胞懸液接種于未包被（遷移）或包被基質(zhì)膠（侵襲）Transwell 上室，下室加入含趨化因子培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h 后將穿膜細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，再加入結(jié)晶紫染色，漂洗干燥，用顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)，即為細(xì)胞遷移或侵襲數(shù)。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 構(gòu)建含有miR-23a-3p 結(jié)合位點(diǎn)的CircSERPINE2 野生型及突變型報(bào)告基因載體，將其分別與miR-23a-3p、miR-NC 轉(zhuǎn)染至RA-FLSs中，按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNA-CircSERPINE2、si-NC、si-Circ-SERPINE2 分別轉(zhuǎn)染至RA-FLSs 中，采用RT-qPCR檢測(cè)CircSERPINE2和miR-23a-3p的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，兩組間比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA患者外周血中CircSERPINE2和miR-23a-3p的表達(dá)情況 RA 患者外周血中CircSERPINE2表達(dá)水平低于健康體檢者，而miR-23a-3p 表達(dá)水平高于健康體檢者（P<0.05，表1）。

表1 檢測(cè)外周血中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 的表達(dá)情況（，n=44）Tab.1 Expressions of CircSERPINE2 and miR-23a-3p in peripheral blood（，n=44）

表1 檢測(cè)外周血中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 的表達(dá)情況（，n=44）Tab.1 Expressions of CircSERPINE2 and miR-23a-3p in peripheral blood（，n=44）

Note：Compared with healthy control group，1）P<0.05.

2.2 RA-FLSs 中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 的表達(dá)情況 與FLSs比較，RA-FLSs中CircSERPINE2表達(dá)水平降低，而miR-23a-3p 表達(dá)水平升高（P<0.05，表2）。

表2 RA-FLSs 中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 表達(dá)的情況（，n=9）Tab.2 Expressions of CircSERPINE2 and miR-23a-3p in RA-FLSs of RA synovial fibroblasts（，n=9）

表2 RA-FLSs 中CircSERPINE2 和miR-23a-3p 表達(dá)的情況（，n=9）Tab.2 Expressions of CircSERPINE2 and miR-23a-3p in RA-FLSs of RA synovial fibroblasts（，n=9）

Note：Compared with FLSs group，1）P<0.05.

2.3 增加CircSERPINE2 表達(dá)可抑制RA-FLSs 的增殖、遷移和侵襲 與pcDNA 組比較，pcDNA-Circ-SERPINE2 組細(xì)胞MMP2 和MMP9 表達(dá)水平降低，CircSERPINE2 表達(dá)水平升高，細(xì)胞活性降低，遷移數(shù)和侵襲數(shù)減少（P<0.05，圖1、表3）。

圖1 Western blot 檢 測(cè)CircSERPINE2 表達(dá)后MMP2、MMP9蛋白表達(dá)Fig.1 Western blot analysis of MMP2 and MMP9 protein expressions after CircSERPINE2 expression

表3 CircSERPINE2低表達(dá)抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞RA-FLSs的增殖、遷移和侵襲（，n=9）Tab.3 Low expression of CircSERPINE2 inhibits proliferation，migration and invasion of RA-FLSs in RA synovial fibroblasts（，n=9）

表3 CircSERPINE2低表達(dá)抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞RA-FLSs的增殖、遷移和侵襲（，n=9）Tab.3 Low expression of CircSERPINE2 inhibits proliferation，migration and invasion of RA-FLSs in RA synovial fibroblasts（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P<0.05.

2.4 抑制miR-23a-3p表達(dá)可抑制RA-FLSs的增殖、遷移和侵襲 與anti-miR-NC 比較，anti-miR-23a-3p組MMP2 和MMP9 表達(dá)水平、miR-23a-3p 表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性降低，遷移數(shù)和侵襲數(shù)減少（P<0.05，圖2、表4）。

圖2 Western blot 檢測(cè)抑制miR-23a-3p 表達(dá)后MMP2、MMP9蛋白表達(dá)Fig.2 Western blot detection of MMP2 and MMP9 protein expressions after inhibition of miR-23a-3p expression

表4 抑制miR-23a-3p表達(dá)抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞RA-FLSs的增殖、遷移和侵襲（，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-23a-3p expression inhibits proliferation，migration and invasion of RA-FLSs in RA synovial fibroblasts（，n=9）

表4 抑制miR-23a-3p表達(dá)抑制RA滑膜成纖維細(xì)胞RA-FLSs的增殖、遷移和侵襲（，n=9）Tab.4 Inhibition of miR-23a-3p expression inhibits proliferation，migration and invasion of RA-FLSs in RA synovial fibroblasts（，n=9）

Note：Compared with anti-miR-NC group，1）P<0.05.

2.5 CircSERPINE2 靶向調(diào)控miR-23a-3p 的表達(dá)

Starbase 預(yù)測(cè)顯示CircSERPINE2 和miR-23a-3p存在結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。miR-23a-3p與CircSERPINE2野生型報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性降低（P<0.05，表5）。與pcDNA 組比較，pcDNA-CircSERPINE2 組CircSERPINE2 表達(dá)水平升高，miR-23a-3p表達(dá)水平降低（P<0.05）；與si-NC 組比較，si-Circ-SERPINE2 組CircSERPINE2 表達(dá)水平降低，miR-23a-3p表達(dá)水平升高（P<0.05，表6）。

圖3 Starbase 對(duì)CircSERPINE2 和miR-23a-3p 結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意圖Fig.3 Schematic diagram of Starbase′s prediction of binding of CircSERPINE2 to miR-23a-3p

表5 miR-NC 或miR-23a-3p 與CircSERPINE2 報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染RA-FLSs 細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè)（，n=9）Tab.5 Detection of dual-luciferase activity after co-transfection of miR-NC or miR-23a-3p and CircSERPINE2 reporter plasmid into RA-FLSs cells（，n=9）

表5 miR-NC 或miR-23a-3p 與CircSERPINE2 報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染RA-FLSs 細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測(cè)（，n=9）Tab.5 Detection of dual-luciferase activity after co-transfection of miR-NC or miR-23a-3p and CircSERPINE2 reporter plasmid into RA-FLSs cells（，n=9）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

表6 RT-qPCR檢測(cè)miR-23a-3p的表達(dá)（，n=9）Tab.6 Expression of miR-23a-3p detected by RT-qPCR（，n=9）

表6 RT-qPCR檢測(cè)miR-23a-3p的表達(dá)（，n=9）Tab.6 Expression of miR-23a-3p detected by RT-qPCR（，n=9）

Note：Compared with pcDNA group，1）P<0.05；compared with si-NC group，2）P<0.05.

2.6 miR-23a-3p 可逆轉(zhuǎn)CircSERPINE2 過(guò)表達(dá)對(duì)RA-FLSs 增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC+pcDNA-CircSERPINE2 組比較，miR-23a-3p+pcDNACircSERPINE2 組MMP2 和MMP9 表達(dá)水平、miR-23a-3p 表達(dá)水平升高，細(xì)胞活性提高，遷移數(shù)、侵襲數(shù)增加（P<0.05，圖4、表7）。

圖4 Western blot檢測(cè)MMP2和MMP9蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot detection of MMP2 and MMP9 protein expressions

表7 miR-23a-3p可逆轉(zhuǎn)CircSERPINE2過(guò)表達(dá)對(duì)RA-FLSs增殖、遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.7 miR-23a-3p can reverse effects of CircSERPINE2 overexpression on proliferation，migration and invasion of RAFLSs（，n=9）

表7 miR-23a-3p可逆轉(zhuǎn)CircSERPINE2過(guò)表達(dá)對(duì)RA-FLSs增殖、遷移和侵襲的影響（，n=9）Tab.7 miR-23a-3p can reverse effects of CircSERPINE2 overexpression on proliferation，migration and invasion of RAFLSs（，n=9）

Note：Compared with miR-NC+pcDNA-CircSERPINE2 group，1）P<0.05.

3 討論

滑膜成纖維細(xì)胞的大量異常增殖是滑膜組織增生的主要原因，其異常增殖可侵蝕軟骨，最終破壞骨關(guān)節(jié)，加重RA 進(jìn)展［9-10］。因此，深入了解RAFLSs 異常增殖的分子機(jī)制，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因抑制RA-FLSs 異常增殖是有效防治RA 的重要途徑和方法。研究報(bào)道circSERPINE2 通過(guò)調(diào)節(jié)miR-495/TGFBR2 軸減弱IL-1β 引起的軟骨細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)降解，是骨關(guān)節(jié)炎治療的新靶點(diǎn)［11］。Circ-SERPINE2 通過(guò)吸附miR-375 和調(diào) 節(jié)YWHAZ 表 達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RA 患者外周血中CircSERPINE2表達(dá)水平低于健康體檢者，且RA-FLSs 中CircSERPINE2 表達(dá)水平低于正常FLSs，表明CircSERPINE2 可能參與RA 的發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步過(guò)表達(dá)CircSERPINE2 后，MMP2、MMP9表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)減少，表明過(guò)表達(dá)CircSERPINE2 可抑制RA-FLSs 的增殖、遷移和侵襲。

研究報(bào)道m(xù)iR-23a-3p 在RA 中失調(diào)表達(dá)，可能在甲氨蝶呤治療的RA 患者血液來(lái)源的CD19+B 細(xì)胞中具有重要的調(diào)節(jié)功能［13］。新風(fēng)膠囊可通過(guò)下調(diào)miR-23a-3p 表達(dá)降低骨關(guān)節(jié)炎患者的炎癥反應(yīng)［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RA 患者外周血及RA-FLSs中miR-23a-3p 表達(dá)水平升高，與在骨關(guān)節(jié)炎中表達(dá)趨勢(shì)一致。抑制miR-23a-3p 表達(dá)后，MMP2、MMP9表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性下降，遷移數(shù)和侵襲數(shù)減少；表明抑制miR-23a-3p 表達(dá)可抑制RA-FLSs 的增殖、遷移和侵襲。此外，本實(shí)驗(yàn)還證實(shí)CircSERPINE2 靶向調(diào)控miR-23a-3p，而miR-23a-3p 過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)CircSERPINE2過(guò)表達(dá)對(duì)RA-FLSs的影響。

綜上所述，CircSERPINE2 過(guò)表達(dá)可通過(guò)靶向調(diào)控miR-23a-3p 抑制RA 滑膜成纖維細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。