自動定氮儀測定人血白蛋白中的總氮含量

武晗燕，蘇芳，郭雷

（北京市藥品檢驗所，北京，100035）

蛋白質含量是人血白蛋白質量評價的重要指標。傳統(tǒng)上氮含量測量的方法為半微量凱氏定氮法[1]，凱氏定氮法也是國家標準方法[2]，該方法雖不需復雜的儀器設備，但存在步驟多，操作復雜，實驗結果受操作環(huán)節(jié)和人為因素影響大,分析效率低等問題，已不能滿足快速批量測試要求。自動定氮儀是在經典定氮蒸餾裝置的基礎上開發(fā)研制的，使用該設備在幾分鐘內即自動完成蒸餾、滴定和結果計算。滴定系統(tǒng)采用顏色判定終點法，避免人工蒸餾、滴定的繁瑣過程，大大提高了工作效率。為了充分發(fā)揮利用自動定氮儀測定人血白蛋白中氮含量提供方法，從而提高人血白蛋白中氮含量測定的效率，本文對自動定氮儀法與半微量凱氏定氮蒸餾定氮法做了比較研究。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用催化劑、硼酸吸收液，混合指示劑、硫酸滴定液等均按《中國藥典》2010年版二部中的要求配制，自動定氮儀用催化劑為儀器自帶市售產品。人血白蛋白為A廠家生產進口人血白蛋白。

1.2 主要試驗儀器

自動定氮儀，型號KJELTEC 8400，瑞典FOSS公司產品，具有凱氏蒸餾和自動滴定功能,最小滴定單位為0.004mL，可根據滴定缸內溶液顏色變化進行終點判定，蒸餾體積達250ml；儀器配有內置恒溫器的消化器，控溫范圍為50~440℃。分析儀專用消化管體積為250 mL。

1.3 方法

1.3.1 測試方法選擇

1.3.1.1 半微量凱氏定氮法

量取人血白蛋白1ml，將試樣置于凱氏燒瓶底部，加入1.0 g消化劑，8mL硫酸，置于電爐上，用小火加熱，待瓶內反應緩和后，加強火力使消煮的土液保持微沸，待消煮液全部為澄明的綠色后，繼續(xù)消煮10分鐘，冷卻，待蒸餾。在消化樣品的同時，做2份空白測定，除不加人血白蛋白外，其他操作皆與測定樣品時相同。蒸餾前先檢查蒸餾裝置是否漏氣，并通過水的溜出液將管道洗凈。用少量水將消煮液全部轉入蒸餾器內，并用水洗滌凱氏瓶4～5次。于150 ml三角瓶中，加入10 ml2%硼酸-指示劑混合液，放在冷凝管末端，然后向蒸餾器內加入10ml 40%氫氧化鈉溶液，通入蒸汽蒸餾，待鎦出液體積約50 ml，即蒸餾完畢。用0.005 mol/L硫酸（或0.01 mol/L鹽酸）標準溶液滴定鎦出液由藍綠色至剛變?yōu)榧t紫色，記錄所用酸滴定液的體積，代入計算公式，計算人血白蛋白中的含氮量。

1.3.1.2 自動定氮儀定氮法

量取人血白蛋白1ml置于250 ml消化管，加入1片消化劑（約5g），8mL硫酸，將消煮管接上回流裝置或插上彎頸玻璃漏斗后，置于消化器中低溫加熱，待管內反應緩和時(約10~15 min)，提高溫度至420 ℃，繼續(xù)消化。待消煮液全部為澄明的綠色后，再繼續(xù)消煮10分鐘，消化完畢，冷卻，待蒸餾。在消煮樣品的同時，做2份空白測定，除不加人血白蛋白外，其他操作皆與測定土樣時相同。蒸餾前按使用說明書檢查自動定氮儀，并空蒸0.5 h洗凈管道。然后在儀器中設定加入50 ml去離子水、30 ml 2%硼酸-指示劑混合液、80ml 40%氫氧化鈉溶液，將消化管置于自動定氮儀上進行蒸餾、滴定，同時先做2個空白試驗，空白測定所用標準溶液的體積，記錄樣品消耗滴定液體積，代入計算公式，計算人血白蛋白中的含氮量。

2 結果與討論

2.1 蒸餾體積的確定

蒸餾體積是指確保樣品蒸餾完全、結果準確前提下的最小蒸餾液體積，在試驗條件確定的情況下，其與蒸餾時間相對應。同一樣品在不同蒸餾體積下氮含量的測定結果見表1。由于樣品中的氮經消化后以( NH4 )2SO4 形式存在，在強堿條件下很容易蒸餾。由表1可以看出，當蒸餾體積達到125 mL時試樣已基本蒸

餾完全，因此設定蒸餾體積為150 mL，蒸餾時間約4. 5 min。雖然儀器法的蒸餾體積是凱氏定氮法的2倍，但凱氏定氮法的蒸餾時間為10~ 12min[1]，且不包括滴定時間，而儀器法是蒸餾、滴定同步進行，因此試驗時間可縮短2/3。

表1 同一樣品不同蒸餾體積下氮含量測定結果

2.2 自動定氮儀與半微量凱氏定氮法實驗結果

分別采用自動定氮儀與半微量凱氏定氮法對同一樣品中氮含量進行測定，結果見表2。

表2 自動定氮儀與半微量凱氏定氮法實驗結果對比

由以上結果可以看出，采用自動定氮儀法測得的結果比傳統(tǒng)半微量凱氏定氮法組內相對標準偏差即變異系數(shù)要小，相對后者精密度更好[3]。

3 結論

兩種方法的測定結果基本相同，兩者無顯著性差異。 試驗時間可縮短2/ 3。同時，由于實現(xiàn)了機電一體化控制，消化時可自動控溫，縮短了消化時間；使用大消化管，消化時樣品無發(fā)泡、爬壁和粘貼現(xiàn)象，保證試樣消化完全；從消化到蒸餾、滴定無試樣轉移過程，滴定終點可自動識別，減少了人為因素造成的誤差。

[1]中華人名共和國國家標準GB/T 5009.5.2003 蛋白質測定的國標規(guī)定方法: 凱氏定氮法.

[2]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典(二部)[M ].北京: 化學工業(yè)出版社.

[3]鄭用熙. 分析化學中的數(shù)理統(tǒng)計方法[ M]. 北京: 科學出版社.