消斑固斑片多環(huán)節(jié)抑制和穩(wěn)定易損斑塊的機(jī)制研究*

孫慧君

(河南中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，河南鄭州450002)

研究表明:易損斑塊破裂和崩解是多因素、多環(huán)節(jié)作用的結(jié)果。從炎性反應(yīng)、脂質(zhì)浸潤、斑塊內(nèi)新生血管等方面詮釋動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的易損性，對(duì)研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展機(jī)制的探討有著重要作用，也為臨床上診斷動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊、治療急性血管事件提供了思路和靶標(biāo)［1］。消斑固斑片是課題組在易損斑塊“微型痰瘀毒“理論基礎(chǔ)上研制的有效方藥。該方藥能有效地抗炎、降脂、逆轉(zhuǎn)或消退AS斑塊和促進(jìn)新生血管生成。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上，重點(diǎn)探討消斑固斑片對(duì)脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)和斑塊內(nèi)新生血管數(shù)的干預(yù)作用，探討其穩(wěn)定易損斑塊的機(jī)制及藥效學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

新西蘭純種白兔46只，體質(zhì)量1.5～2.5 kg，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):2005－0012。

1.2 藥品、試劑與儀器

消斑固斑片由余甘子30 g、神曲15 g、山楂30 g等藥物組成，由河南中醫(yī)學(xué)院中藥制劑室制備，每粒0.46 g，相當(dāng)于含生藥6.0 g。中國斑點(diǎn)蛙蛇毒由廣州蛇毒研究所提供，批號(hào)gz－03;血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，單克隆抗體試劑盒(批號(hào)AZ－001)，高超敏C－反應(yīng)蛋白(hs-CRP)(批號(hào)17320501)和脂蛋白磷脂酶A2(LP-PLA2)酶聯(lián)免疫試劑盒(批號(hào)CSBE06937Ca)，均由武漢博士德生物工程公司提供。LDZ5－2離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠產(chǎn)品;MS1型快速組織均勻漿機(jī)，無錫沃信儀器有限公司產(chǎn)品;MP200－A型電子天平，上海精密儀器廠產(chǎn)品;病例圖像分析系統(tǒng)，江省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

1.3 高脂飼料的制備

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)并參考文獻(xiàn)［2］加以改進(jìn)，配方:豬油(占10%)、質(zhì)量濃度1.5%膽固醇(占1.5%)、膽鹽(占 0.2%)、蛋黃粉(占 5.0%)、甲基硫氧嘧啶(占 0.2%)、基礎(chǔ)飼料(占83.1%)。

1.4 模型的建立、分組與給藥

經(jīng)兔耳緣靜脈注射30 g/L戊巴比妥鈉(30μg/g)麻醉，無菌條件下做頸正中切口;分離右頸總動(dòng)脈，兩端以動(dòng)脈夾阻斷血流;1 mL注射器針頭刺入右頸總動(dòng)脈，生理鹽水沖洗置換出血管內(nèi)的血液后抽空血管腔;無菌注射器抽取液氮快速注入右頸總動(dòng)脈(液氮在血管內(nèi)即刻氣化為超低溫氮?dú)?，反復(fù)3次，歷時(shí)約2 min，以造成血管內(nèi)皮凍傷;放開動(dòng)脈夾恢復(fù)血流，壓迫止血;常規(guī)使用抗生素預(yù)防感染，術(shù)后高脂飼料喂養(yǎng)8周。于8周末，隨機(jī)抽取2只兔，病理切片證明As破裂斑塊形成。將造模成功兔隨機(jī)分為模型對(duì)照組和消斑固斑組兩組，每組10只。模型對(duì)照組用生理鹽水灌胃，消斑固斑組用消斑固斑片藥液1.2g/kg灌胃，兩組均按 2.0μL/g體質(zhì)量給藥，2次/d，連續(xù)灌胃15 d。兩組均予高脂飲食至服藥結(jié)束。于處死動(dòng)物前24，48 h參考Constantinides等［3］方法進(jìn)行藥物觸發(fā):中國斑點(diǎn)蛙蛇毒0.15μg/g腹膜下注射，30 min后，耳緣靜脈注射組織胺0.02μg/g，以促使斑塊發(fā)生實(shí)驗(yàn)性破裂。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 標(biāo)本采集與處理

實(shí)驗(yàn)開始第8周末及第10周末，禁食12 h以上，清晨空腹耳中動(dòng)脈采血，離心，留取上清液，取出血清備用。另以斑塊破裂部位為中心，以3 mm厚度橫斷連續(xù)取材(包括病變部位上下端的正常動(dòng)脈)，100 g/L福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色。

1.5.2 易損斑塊形態(tài)學(xué)指標(biāo)

光學(xué)顯微鏡下觀察易損斑塊形態(tài)學(xué)變化，包括:血管外彈力膜面積(externaielastic membrance area，EEMA)，管腔面積(lumen area，LA)，斑塊面積(plaque area，PA)。

1.5.3 斑塊內(nèi)新生血管數(shù)的變化

采用IMS型彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量每1個(gè)切片斑塊的總面積，然后根據(jù)測(cè)量的多個(gè)指標(biāo)，來計(jì)算斑塊的平均面積。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊區(qū)內(nèi)小的棕色團(tuán)，其中管腔直徑＞10μm者即為新生血管。計(jì)算400倍視野中新生血管數(shù)，隨機(jī)測(cè)定5個(gè)視野，取其均值作為該樣本的測(cè)定值。

1.5.4 斑塊內(nèi)VFGF蛋白表達(dá)水平

采用免疫組化檢測(cè)斑塊內(nèi)VFGF蛋白水平陽性表達(dá)。胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃顆粒沉著為VFGF陽性反應(yīng)，用TIGER－920G細(xì)胞圖像分析儀測(cè)定5個(gè)視野bFGF陽性染色的平均光密度值(AOD)，取其均值以代表斑塊內(nèi)VFGF蛋白表達(dá)的水平。

1.5.5 血清 LP-PLA2、hs-CRP

采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法方法測(cè)定血清中LP-PLA2、hs-CRP水平的變化，按 ELISA試劑盒說明書操作。

1.5.6 TC、TG、HDL-C、LDL-C

采用酶法檢測(cè)TC、TG，磷鎢酸－鎂沉淀法檢測(cè)HDL-C、LDL-C。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)()±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組易損斑塊形態(tài)學(xué)指標(biāo)對(duì)比

與模型對(duì)照組對(duì)比，消斑固斑組頸動(dòng)脈EEMA、LA和PA面積縮小，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明消斑固斑片具有較好消斑固斑作用。見表1。

表1 兩組易損斑塊形態(tài)學(xué)指標(biāo)對(duì)比 s

表1 兩組易損斑塊形態(tài)學(xué)指標(biāo)對(duì)比 s

注:與模型對(duì)照組對(duì)比，*P ＜0.05。

組 別 動(dòng)物數(shù) PA/mm2 EEMA/mm2 LA/mm2 8 5.89 ±3.29 14.45 ±1.30 8.3 ±4.24消斑固斑組 8 2.55 ±1.04* 9.48 ±1.96* 6.93 ±2.12模型對(duì)照組*

2.2 兩組易損斑塊VFGF蛋白表達(dá)水平和新生血管數(shù)量對(duì)比

與模型對(duì)照組對(duì)比，消斑固斑組斑塊內(nèi)新生血管數(shù)量、VEGF蛋白陽性表達(dá)明顯降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明消斑固斑片通過降低VEGF在粥樣斑塊中的表達(dá)，抑制斑塊內(nèi)新生血管形成，達(dá)到穩(wěn)定斑塊的作用。見表2。

表2 兩組易損斑塊VFGF蛋白表達(dá)水平和新生血管數(shù)量對(duì)比 ± s

表2 兩組易損斑塊VFGF蛋白表達(dá)水平和新生血管數(shù)量對(duì)比 ± s

注:與模型對(duì)照組對(duì)比，*P ＜0.05。

組 別 動(dòng)物數(shù) VEGF表達(dá)/AOD 每個(gè)視野內(nèi)新生血管數(shù)量/個(gè)0.32 ±0.09 183.5 ±1.8消斑固斑組 8 0.18 ±0.04* 97.9 ±0.45模型對(duì)照組8*

2.3 兩組血清LP-PLA2、hs-CRP水平對(duì)比

模型對(duì)照組治療前后血清LP-PLA2變化明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，顯示炎癥反應(yīng)在斑塊演變過程逐漸加重，表明斑塊破裂與血清LPPLA2具有相關(guān)性。消斑固斑組治療前后血清LPPLA2、hs-CRP變化不明顯，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);治療后血清 LP-PLA2、hs-CRP 相比，治療組LP-PLA2、hs-CRP降低明顯，P ＜0.05，說明固斑消斑片可通過抑制血清LP-PLA2、hs-CRP減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，防止破裂斑塊的作用。見表3。

表3 兩組血清LP-PLA2、hs-CRP水平對(duì)比

2.4 兩組 TC、TG、HDL-c、LDL-c對(duì)比

模型對(duì)照組血脂前后相比變化明顯(P＜0.05)，消斑固斑組血脂治療前后相比變化不明顯(P＞0.05);兩組治療后相比，治療組血脂降低明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明消斑固斑片降血脂效果明顯。見表4。

表4 兩組 TC、TG、HDL-c、LDL-c 對(duì)比 mmol·L－1，± s

表4 兩組 TC、TG、HDL-c、LDL-c 對(duì)比 mmol·L－1，± s

注:與模型對(duì)照組治療后對(duì)比，*P＜0.05;與本組治療前對(duì)比，#P＜0.05。

TC TG HDL-C LDL-C模型對(duì)照組 8 治療前組 別 動(dòng)物數(shù) 時(shí)間4.8 ±0.79 3.08 ±0.47 2.01 ±0.5 3.49 ±0.75治療后 10.12 ±1.91# 7.08 ±0.53# 1.98 ±0.83# 5.88 ±0.23#消斑固斑組 8 治療前 4.89±0.47 3.12±0.32 2.02±0.23 3.75±0.41治療后 5.12 ±1.81* 4.69 ±0.12* 2.84 ±0.41* 3.90 ±0.57*

3 討論

易損斑塊是指那些不穩(wěn)定和有血栓形成傾向的斑塊，主要包括破裂斑塊、侵蝕性斑塊和部分鈣化結(jié)節(jié)性病變。2003年Naghvi等［4］給出了易損斑塊的組織學(xué)定義和標(biāo)準(zhǔn)，主要的標(biāo)準(zhǔn)包括活動(dòng)性炎癥、薄的纖維帽和大的脂質(zhì)核心。研究表明:斑塊內(nèi)新生的微血管與炎癥、纖維帽厚度、脂核大小一樣，被認(rèn)為是目前斑塊破裂的最有利的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。炎性反應(yīng)及炎性介質(zhì)對(duì)不穩(wěn)定斑塊的破裂起著至關(guān)重要的作用，也作為外因影響著板塊的穩(wěn)定性。在晚期斑塊中，隨著纖維帽的形成，固有管腔來源的炎性細(xì)胞減少，但斑塊內(nèi)形成的新生血管具有更強(qiáng)的介導(dǎo)炎性細(xì)胞趨化并進(jìn)入斑塊的能力。因此，新生血管和炎性細(xì)胞之間可能存在著正反饋環(huán)路:一方面新生血管表達(dá)粘附分子并趨化聚集炎細(xì)胞進(jìn)入斑塊，另一方面斑塊局部的炎細(xì)胞又產(chǎn)生生長因子并促進(jìn)血管新生。二者互相促進(jìn)，導(dǎo)致了斑塊的不穩(wěn)定。目前中醫(yī)藥治療易損斑塊的臨床研究主要集中在消除、穩(wěn)定易損斑塊和通過抑制易損斑塊的崩解而降低急性心腦血管疾病的發(fā)生［5－6］;在實(shí)驗(yàn)研究方面，以探討中醫(yī)藥對(duì)AS抑制平滑肌細(xì)胞增殖、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)血脂代謝、抗脂質(zhì)過氧化等作用機(jī)制［7－8］為主。課題組基于痰瘀是斑塊形成病理基礎(chǔ)，毒邪是斑塊潰爛、崩解的導(dǎo)火索，因痰致瘀、痰瘀互結(jié)、變從毒起是易損斑塊病理演變的認(rèn)識(shí)，采用化瘀降濁排毒法的代表方——消斑固斑片治療易損斑塊。消斑固斑片由余甘子、荷葉、山楂、澤瀉、大黃等組成。方中余甘子歸肝脾胃經(jīng)，擅長滌化濁脂、消痰理氣，以除血中無形之脂，使?jié)峤刀厩?，為君藥。荷葉有理氣散滯之功，通血活氣，使?jié)峄鱿?，為臣藥。山楂味酸而甘，善消肉食油膩之積;澤瀉利水滲濕，使?jié)嶂瑵穸局皬男”愣?大黃滌蕩腸胃，推陳出新，使?jié)狃龆緹嶂皬年柮鞫?。?藥共佐君臣消斑固斑之功［9－12］。

本研究發(fā)現(xiàn):消斑固斑片可明顯使總膽固醇、LDL-C降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，此外，頸動(dòng)脈的 EEMA、LA、PA較模型對(duì)照組變小(P＜0.05)，說明消斑固斑片具有較好的消斑固斑作用。VEGF是有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的生長因子，在血管新生過程中具有重要意義，抑制VEGF在動(dòng)脈粥樣斑塊中的表達(dá)可在一定程度上控制斑塊生長進(jìn)程。消斑固斑組與模型對(duì)照組對(duì)比，斑塊內(nèi)新生血管數(shù)量、VEGF蛋白陽性表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，說明消斑固斑片通過抑制VEGF在粥樣斑塊中的表達(dá)，減少斑塊內(nèi)血管新生，達(dá)到穩(wěn)定斑塊的作用。血清LP-PLA2、hs-CRP活性能反映冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變的嚴(yán)重程度。消斑固斑片可使血清LPPLA2、hs-CRP降低明顯，顯示消斑固斑片通過抑制血清LP-PLA2、hs-CRP來減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，防止破裂斑塊作用。綜上所述，消斑固斑片通過影響脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)和斑塊內(nèi)血管新生，從多環(huán)節(jié)、多角度有效地逆轉(zhuǎn)或消除斑塊、防止斑塊破裂。此為臨床治療易損斑塊、降低急性血管事件發(fā)生，提供了思路和靶標(biāo)。

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