低溫乳酸菌混菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

田菊梅，梁 琪，張 炎，楊 敏，文鵬程，張衛(wèi)兵，*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，甘肅蘭州730070)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一類能利用可發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸的細菌的統(tǒng)稱，具有諸多生物學(xué)功效，如抗腫瘤、降血脂、提高免疫力等［1］。乳酸菌作為一種益生資源，越來越為人們所重視，但是對低溫環(huán)境中生長的乳酸菌的研究相對還較薄弱。所謂低溫發(fā)酵劑主要是由最適生長溫度介于20～30℃之間的微生物組成的，最常用的包括乳球菌和明串珠菌［2］。目前國內(nèi)外的報道多集中于低溫冷藏肉、發(fā)酵香腸、魚制品及泡菜中。工業(yè)生產(chǎn)上通常使用2種或多種菌株共同發(fā)酵，即混菌培養(yǎng)或混菌發(fā)酵，以改進單菌株發(fā)酵的不足，目前混菌培養(yǎng)在食品發(fā)酵、環(huán)境保護和能源方面已有一些研究和應(yīng)用［3］?；炀囵B(yǎng)可以充分利用菌株的共生作用，并能克服中間產(chǎn)物過大對菌株生長造成不利影響，從而提高目的產(chǎn)物得率。高密度培養(yǎng)過程中使用混菌培養(yǎng)，可以利用菌株間的共生關(guān)系，顯著提高菌體細胞的濃度?；炀囵B(yǎng)過程會受到諸多因素的影響，如培養(yǎng)液的初始pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、接種量、菌種活力、培養(yǎng)周期等。目前已有研究表明，對這些工藝參數(shù)進行優(yōu)化，可以在很大程度上提高培養(yǎng)液的細胞濃度［4-5］。前期研究表明，分離自甘南牧區(qū)的在低溫條件下性能優(yōu)良的干酪乳桿菌和乳酸乳球菌在復(fù)配發(fā)酵酸奶時具有良好的共生關(guān)系。本研究主要以這兩株低溫乳酸菌為研究對象，在改良MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對其混菌培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，為實現(xiàn)低溫乳酸菌的高密度培養(yǎng)，制備質(zhì)量穩(wěn)定的直投式低溫乳酸菌發(fā)酵劑提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌(Lactobacillus casei，保藏號CGMCC 4775)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，保藏號CGMCC4776) 甘肅省功能乳品工程實驗室分離并保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心;牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、乙酸鈉、檸檬酸二胺、K2HPO4、吐溫-80、MgSO4、MnSO4等 北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，分析純;脫脂乳培養(yǎng)基 將脫脂乳粉用蒸餾水復(fù)原成12%(W/V)的脫脂乳，115℃滅菌10min;改良 MRS液體培養(yǎng)基［6］蛋白胨10g，牛肉膏 10g，胰蛋白胨 5g，K2HPO4·3H2O 2g，乙酸鈉5g，葡萄糖 23g，吐溫 80 1mL，檸檬酸二銨 2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·4H2O 0.25g，4% 土豆汁，6%胡蘿卜汁，8%番茄汁，加蒸餾水至1000mL，調(diào)節(jié)p H6.2～6.4，121℃滅菌 15min備用;計數(shù)培養(yǎng)基 MRS瓊脂培養(yǎng)基。

SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;YX-280A不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司;HG303-4電熱恒溫培養(yǎng)箱 南京實驗儀器廠;PB-203電子天平 Mettler-Toledo公司;PHS-3C型數(shù)顯酸度計 雷磁分析儀器廠;754PC型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化 將冷凍保藏的兩菌株在室溫下解凍后，無菌條件下接種到MRS液體培養(yǎng)基中富集，再按3%(V/V)比例轉(zhuǎn)接到脫脂乳培養(yǎng)基中，25℃恒溫條件下培養(yǎng)至凝乳，重復(fù)5～6次以恢復(fù)菌株活力［7］。

1.2.2 種子液制備 兩菌株充分活化后，以接種量3%(V/V)分別接入MRS液體培養(yǎng)基，于25℃恒溫培養(yǎng)14h得到種子液。

1.2.3 培養(yǎng)條件對低溫乳酸菌生長的影響

1.2.3.1 培養(yǎng)溫度對低溫乳酸菌生長的影響 將種子液以球桿菌比例2∶1(V/V)、接種量3%(V/V)接入液體 MRS 培養(yǎng)基中，分別在 19、22、25、28、31℃培養(yǎng)，每隔2h進行活菌計數(shù)，考察溫度對乳酸菌生長的影響。

1.2.3.2 初始p H對低溫乳酸菌生長的影響 將MRS液體培養(yǎng)基初始 p H 分別調(diào)為5.4、5.8、6.2、6.6、7.0，按球桿菌比例 2∶1(V/V)、接種量 3%(V/V)進行接種后于25℃培養(yǎng)，每隔2h進行活菌計數(shù)，考察初始pH對乳酸菌生長的影響。

1.2.3.3 接種量對低溫乳酸菌生長的影響 分別以1%、2%、3%、4%、5%(V/V)的接種量將乳酸菌按球桿菌比例2∶1(V/V)接種于初始pH6.6的發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃條件下進行培養(yǎng)，每隔2h進行活菌計數(shù)，考察接種量對乳酸菌生長的影響。

1.2.4 低溫乳酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化 根據(jù)Box-Benhnken實驗設(shè)計原理，選取接種量、起始pH和培養(yǎng)溫度三個因素為Box-Benhnken實驗設(shè)計的自變量，以活菌數(shù)對數(shù)值為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析(Response Surface Analysis，RSA)進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化［8-10］。響應(yīng)面設(shè)計因素水平表如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計因素水平表Table 1 Levels and codes of variables of response surface analysis(RSM)

1.2.5 菌體生長的測定 采用稀釋平板法計數(shù)［11］。無菌操作條件下用無菌生理鹽水(0.85%NaCl)將培養(yǎng)液稀釋至一定稀釋度，取0.1mL涂布于計數(shù)培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)48h，選取菌落數(shù)在30～300之間的平板進行菌落計數(shù)，每個樣品重復(fù)3次，活菌數(shù)用lgCFU/mL表示。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 用Microsoft Excel 2003整理實驗數(shù)據(jù)，并采用SPSS17.0中t檢驗進行組間及組內(nèi)顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 培養(yǎng)溫度對低溫乳酸菌生長的影響 溫度是影響微生物生長繁殖最重要的因素之一［12］。溫度對低溫乳酸菌活菌數(shù)的影響見圖1。由圖1可知，混合菌株在培養(yǎng)溫度分別為 19、22、25、28、31℃時，達到穩(wěn)定期時活菌數(shù)對數(shù)值分別為9.68、10.01、10.25、9.97、9.87lgCFU/mL。隨著溫度的增大，菌體濃度呈先增大后減小的趨勢。19℃時菌體生長緩慢，菌體濃度最低，隨著溫度的升高，菌體濃度也顯著地提高(p＜0.01);25℃時菌體濃度達到最大值，高于此溫度，菌體濃度又顯著地降低(p＜0.01);22℃時菌體濃度較28、31℃時高，但統(tǒng)計學(xué)差異不顯著(p＞0.05)。菌株的最適生長溫度范圍不同，這與它們長期進化過程中所處環(huán)境溫度有關(guān)。本實驗所用的菌株分離自甘南牧區(qū)牦牛酸乳中，該地區(qū)長年溫度較低，因而分離得到菌株的最適生長溫度也較低。Gassem等［13］認為過低的接種溫度使活菌數(shù)量增加緩慢，溫度過高，菌體又大量死亡，活菌數(shù)下降，與本實驗結(jié)果一致。

圖1 溫度對乳酸菌活菌數(shù)的影響Fig.1 The effect of temperature on LAB counts

2.1.2 初始pH對低溫乳酸菌生長的影響 p H對微生物生長繁殖的影響也很大［14］。初始p H對低溫乳酸菌影響見圖2。由圖可知，混合菌株在初始pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 時，達到穩(wěn)定期時的活菌數(shù)對數(shù)值分別為 9.48、9.58、9.90、10.28、10.04lgCFU/mL。p H為6.5時菌體生長最快，高于或低于此p H，菌體濃度均顯著地降低(p＜0.01);培養(yǎng)時間約大于15h時，p H7.0時菌體濃度稍高于pH6.0，但差異不顯著(p＞0.05)。pH過低時，由于大量氫離子的存在，導(dǎo)致膜脂飽和度下降，從而影響乳酸菌的繁殖，隨著p H的增大這種抑制作用逐漸減小，當(dāng)p H超過6.5以后，抑制作用又開始增加。李妍等研究了起始pH對Lactobacillus casei Zhang生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p H在5.9時活菌數(shù)最多，高于或低于此值活菌數(shù)都會降低［15］。另外還有研究表明不同菌種的最適p H也不同，乳桿菌通常在pH5.5～6.0時生長良好。

圖2 初始pH對乳酸菌活菌數(shù)的影響Fig.2 The effect of initial pH value on LAB counts

2.1.3 接種量對低溫乳酸菌生長的影響 接種量的大小會明顯影響延滯期的長短，從而影響整個生長周期。一般來說，接種量大，則延滯期短，反之則長。接種量對低溫乳酸菌活菌數(shù)的影響見圖3。由圖可知，混合菌株在接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%時，達到穩(wěn)定期時的活菌數(shù)分別為9.43、9.78、10.29、10.07、9.69 lgCFU/m L。在接種量1%～3%時，菌體濃度呈逐漸增大的趨勢，隨后菌體濃度開始降低。接種量3%時菌體濃度達到最大值，顯著高于1%、2%、4%、5%(p＜0.05)，而2%接種量與5%接種量之間菌體濃度不存在顯著性差異(p＞0.05)。由于接種量過多時，微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭增強，導(dǎo)致部分菌體死亡。謝麗源研究了混菌培養(yǎng)過程中接種量對乳酸菌生長的影響，結(jié)果表明:接種量為3%時，生長速率最快，接種量低于或高于3%，乳酸菌的生長都會受到不同程度的削弱，產(chǎn)酸速度減慢［16］。

圖3 接種量對乳酸菌活菌數(shù)的影響Fig.3 The effect of inoculation on LAB counts

2.2 低溫乳酸菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

綜合單因素實驗結(jié)果，選取培養(yǎng)溫度、起始pH及接種量為自變量，活菌數(shù)對數(shù)值為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法對其進行優(yōu)化，實驗結(jié)果見表2。

利用Design Expert 7.0擬合實驗結(jié)果得到回歸方程，以Y代表響應(yīng)值，以X1、X2、X3分別代表接種量、初始pH、培養(yǎng)溫度。該實驗的回歸方程為:

對該回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，該模型達到極顯著水平(p＜0.001)，方程的失擬項不顯著(p=0.064)，說明方程誤差較小，回歸方程的擬合程度良好?；貧w方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9901，表明方程模型與實驗數(shù)據(jù)有99.01%的符合度，可用該方程代替真實實驗點進行分析。因素的一次項、二次項對響應(yīng)值的影響極顯著(p＜0.01)，同時溫度和接種量的交互作用也極顯著(p＜0.01)。

表2 Box-Benhnken實驗設(shè)計及實驗結(jié)果Table 2 Test design and results of Box-Benhnken

表3 Box-Benhnken實驗方差分析Table 3 Analysis of variance for Box-Benhnken

以活菌數(shù)對數(shù)值作為響應(yīng)值，繪制接種量與起始pH、接種量與培養(yǎng)溫度、起始pH與培養(yǎng)溫度之間的三維響應(yīng)曲面圖，分別見圖4～圖6。

圖4 接種量和初始pH對乳酸菌生長影響的響應(yīng)面圖Fig.4 The effect of inoculation amount and initial pH on LAB counts

圖5 接種量和溫度對乳酸菌生長影響的響應(yīng)面圖Fig.5 The effect of inoculation amount and temperature on LAB counts

圖6 初始pH和溫度對乳酸菌生長影響的響應(yīng)面圖Fig.6 The effect of initial pH and temperature on LAB counts

圖4 顯示了當(dāng)培養(yǎng)溫度為中心水平時，初始pH與接種量對活菌數(shù)的影響?？梢钥闯?，初始pH與接種量不存在交互作用，且初始pH對接種量的影響較培養(yǎng)溫度影響大。圖5顯示了當(dāng)初始pH為中心水平時，培養(yǎng)溫度與接種量對活菌數(shù)的影響，由圖可知，培養(yǎng)溫度與接種量的交互作用最明顯，且培養(yǎng)溫度對響應(yīng)值的影響較接種量影響大。圖6顯示了當(dāng)接種量為中心水平時，培養(yǎng)溫度與初始pH對活菌數(shù)的影響，結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度與初始pH的交互作用不大。

由響應(yīng)面的高點及等值線可以看出，在所選的范圍內(nèi)擬合曲面有極大值，對回歸方程求導(dǎo)，得到極大值為10.32lgCFU/mL，對應(yīng)的溫度為24.32℃、起始pH為6.60、接種量為3.20%。為方便實驗，將溫度定為24.30℃、起始pH定為6.60、接種量定為3.00%。為檢驗響應(yīng)曲面法所得結(jié)果的可靠性，采用上述發(fā)酵條件進行三次平行發(fā)酵實驗，活菌數(shù)分別為:10.25、10.23、10.27lgCFU/mL，平均值為 (10.25 ±0.02)lgCFU/mL，與理論預(yù)測值相比，其相對誤差約為0.99%，說明該數(shù)學(xué)模型對低溫乳酸菌的生長條件預(yù)測較為準確。

3 結(jié)論

乳酸菌的增殖受諸多因素的影響，本實驗通過單因素實驗，研究了培養(yǎng)溫度、起始pH、接種量對低溫乳酸菌混菌培養(yǎng)的影響情況;在此基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken實驗和響應(yīng)面分析對低溫乳酸菌混菌培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，得出最優(yōu)培養(yǎng)條件為:接種量3.00%、起始p H6.60、培養(yǎng)溫度24.30℃。在此培養(yǎng)條件下進行驗證實驗，乳酸菌活菌數(shù)可達(10.25±0.02)lgCFU/mL。

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