超聲波聯(lián)合果膠酸酶提取柚皮果膠的工藝研究

余先純，李湘蘇，韓大良，龔錚午

(1.岳陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，岳陽市洞庭湖區(qū)特色中藥材綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南岳陽414000;2.中南林業(yè)科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長沙410004;3.南華大學(xué)教務(wù)科，湖南衡陽421002)

果膠是天然的高分子多糖聚合物，是從植物材料中制備的一種膠狀多聚體，是膳食纖維的主要成分［1］，具有良好的膠凝性和乳化穩(wěn)定性，在食品、藥品、保健品行業(yè)有著廣泛用途［2］。柚皮作為果實(shí)廢棄物，果膠含量豐富，若將柚皮果膠充分提取、利用，不僅可以提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還具環(huán)保效應(yīng)。果膠的提取有酸提取乙醇沉淀法、離子交換法、酸提取鹽沉淀法以及微生物法等多種方法［3］，但商業(yè)上多使用無機(jī)酸來提取。Willats［4］探討了從蘋果渣中提取果膠;Maria和Sakai［5-6］等研究了無機(jī)酸水解法提取果膠，但無機(jī)酸提取存在著諸如得率低、能耗高、污染環(huán)境等不足［7］。超聲波具有空化、機(jī)械振動(dòng)、微射流及微聲流等多級物理效應(yīng)，能促使植物細(xì)胞組織破壁或變形，從而用于天然產(chǎn)物的輔助提取，并取得了良好的效果［8］。而酶法提取條件溫和、能耗低、無污染［9］，是針對生物制藥所設(shè)計(jì)的一種新型的植物提取工藝。目前關(guān)于利用超聲波聯(lián)合酶法提取柚皮果膠的研究還未見相關(guān)報(bào)道。本研究以柚皮為原料，采用超聲波聯(lián)合復(fù)合酶法提取柚皮果膠，改變傳統(tǒng)提取方法的不足，為果膠的生產(chǎn)提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

柚皮 從市場購得;去離子水 自制;醋酸-醋酸鈉緩沖溶液、果膠酸酶(2×104U/mL) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;乙醇 分析純。

數(shù)控超聲波發(fā)生器 杭州成功超聲設(shè)備有限公司;101A數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 吳江峻宇機(jī)械設(shè)備有限公司;JJ-2-高速組織搗碎機(jī) 金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;pHS-828精密型酸度計(jì) 北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司;HH-2電熱恒溫水浴鍋 上海比朗儀器有限公司;TDZ5-WS低速離心機(jī) 長沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司;660傅立葉變換紅外光譜儀 安捷倫科技有限公司。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experiments design

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取粒度為50目的柚皮粉末50g，加入一定量的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，置于數(shù)控超聲波發(fā)生器中，在一定功率的超聲波作用下處理一定時(shí)間。

待混合液冷卻至室溫后加入一定量的果膠酸酶，置于恒溫水浴鍋中，在一定的溫度和一定時(shí)間下提取1～4次，將所得到的提取液經(jīng)過5000r/min離心10min。用蒸餾水清洗殘?jiān)?，離心，合并上清液。

上清液85℃水浴滅酶5min，冷卻，用95%的乙醇清洗，5000r/min離心6min，分離沉淀出的果膠，再用95%乙醇清洗兩次，每次6min，以除去色素和游離的中性糖，將果膠置于50℃的真空干燥箱中干燥2.5h，計(jì)算出得率。采用常規(guī)水浴加熱提取法在相同的工藝條件下進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)。

1.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在探索性實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用酶提取3次，以超聲波功率(A)、超聲頻率(B)、超聲波處理時(shí)間(C)、單次提取時(shí)間(D)、緩沖液p H(E)、酶提取溫度(F)、酶液用量(G)為研究對象，采用L18(37)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，如表1所示。

1.4 檢測指標(biāo)

按照GB 25533-2010［10］檢測果膠的理化指標(biāo)。

用Varian 660傅立葉變換紅外光譜儀對果膠進(jìn)行紅外光譜分析，掃描范圍4000～500cm-1。

2 結(jié)果與討論

通過一系列的探索性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲波處理時(shí)間與功率、超聲波頻率和緩沖液p H、酶法提取溫度和酶液用量、單次提取時(shí)間和提取次數(shù)等因素對果膠的得率有較大的影響。下面就根據(jù)探索性實(shí)驗(yàn)的基本數(shù)據(jù)對單工藝因素進(jìn)行探討。

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 超聲波處理時(shí)間和功率對提取量的影響 圖1是超聲波功率分別為120、160、200、240W 時(shí)不同反應(yīng)時(shí)間下果膠提取量的變化關(guān)系圖。由圖1可知，超聲波功率對果膠提取量的影響很大，功率低時(shí)，果膠提取量較低;隨著功率的升高，果膠提取量不斷升高，但20min后，功率為200W的提取量與240W的相接近，考慮到生產(chǎn)成本，將功率確定為200W。同時(shí)，從圖1中還發(fā)現(xiàn):當(dāng)功率為200W時(shí)，16min后，果膠提取量增幅趨緩，隨著時(shí)間的延長，提取量曲線幾乎接近水平，這是因?yàn)槌暡艽偈怪参锛?xì)胞組織破壁或變形，使胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來，在提取初期，時(shí)間越長，胞內(nèi)物質(zhì)釋放物越多，果膠的提取量也就越高，隨著時(shí)間的延長，胞內(nèi)釋放物的含量逐步減少，果膠提取量增加不明顯。故將正交實(shí)驗(yàn)中超聲波處理時(shí)間確定為16min。

圖1 超聲波處理時(shí)間和功率對果膠提取量的影響Fig.1 Effect of microwave times and microwave power on the pectin extraction quantity

2.1.2 超聲波處理頻率和緩沖液pH對提取量的影響 圖2是超聲波頻率分別為20、24、28、32kHz時(shí)，不同緩沖液pH與果膠提取量的變化關(guān)系圖。由圖2可知，頻率為20k Hz時(shí)提取量最大，32kHz的最小，24和28kHz的居于中間。這是因?yàn)?頻率低的振幅大，固體物料與流體混合越均勻，提取量越大;但頻率也不是越低越好，因?yàn)轭l率低，能耗高，對設(shè)備的要求也高，而20kHz的果膠提取量略高于24kHz的果膠提取量，但考慮到生產(chǎn)成本及對設(shè)備的要求，選擇24kHz為超聲波頻率。同時(shí)，圖2中也顯示，在處理頻率為24kHz、緩沖液pH為5左右時(shí)的果膠提取量較高，超過5后減少，這可能是因?yàn)閜H為5左右時(shí)酶的活性較好的緣故，因此選定正交實(shí)驗(yàn)中緩沖液的pH為5。

圖2 緩沖液pH和超聲波處理頻率對果膠提取量的影響Fig.2 Effect of pH value of buffer and microwave temperature on the pectin extraction quantity

2.1.3 酶法提取溫度和酶液用量對提取量的影響升高溫度能夠提高反應(yīng)體系的活化能進(jìn)而提高反應(yīng)速度，但太高的溫度又會(huì)使酶液失活［11］，因此合適的提取溫度十分重要。不同溫度和酶液用量對果膠提取量的影響見圖3，當(dāng)酶液用量為0.9%、提取溫度小于55℃時(shí)，隨著溫度升高，果膠的提取量逐漸增加，并在55℃時(shí)提取量達(dá)到222.5mg/g;但當(dāng)溫度繼續(xù)升高，提取量有降低的趨勢。這可能是由于高溫使部分酶失活，因此在本實(shí)驗(yàn)中選取55℃為酶法提取溫度。在55℃時(shí)，酶液用量低于0.7%時(shí)，隨著酶液用量的增加，果膠提取量明顯增加，當(dāng)超過此值時(shí)，果膠提取量增加緩慢。這可以解釋為隨著酶的濃度的升高，與底物的接觸量增大，酶解反應(yīng)速率增大。但當(dāng)酶的濃度達(dá)到過飽和時(shí)，過量的酶難以發(fā)揮作用［11］，因此果膠的提取量增加緩慢。

表2 提取柚皮果膠的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment result of pectin extraction

圖3 提取溫度和酶液用量對果膠提取量的影響Fig.3 Effect of enzyme dosages and extraction temperature on the pectin extraction quantity

2.1.4 單次提取時(shí)間和提取次數(shù)對提取量的影響圖4中顯示了不同提取次數(shù)和不同單次提取時(shí)間對果膠提取量的影響:隨著提取次數(shù)的增加，果膠總提取量不斷增加，4次提取果膠總提取量略高于3次提取果膠總提取量，從生產(chǎn)成本角度考慮提取次數(shù)以3次為宜。由圖4還可知，在提取次數(shù)為3次時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長，果膠總提取量逐漸增加，當(dāng)提取時(shí)間超過50min后再延長時(shí)間，果膠提取量減小。這是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長，果膠分子鏈會(huì)在酶的作用下發(fā)生降解，最終影響果膠的提取量［12］，故將正交實(shí)驗(yàn)中單次提取時(shí)間確定為50min。

圖4 單次提取時(shí)間和提取次數(shù)對果膠提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time every time and times on the pectin extraction quantity

2.2 正交實(shí)驗(yàn)分析

正交實(shí)驗(yàn)見表2，由表2可知，影響果膠提取量的因素順序?yàn)锳＞B＞F＞C＞D＞E＞G，工藝的最佳組合為:A3B2C2D2E3F2G2，即超聲波功率240W、超聲頻率24kHz、超聲波處理時(shí)間20min、單次提取時(shí)間50min、緩沖液 p H5.5、酶提取溫度55℃、酶液用量0.9%，按上述最優(yōu)條件追加3次實(shí)驗(yàn)，萃取柚皮果膠的平均提取量為236.2mg/g。

2.3 紅外光譜分析

果膠的紅外光譜見圖5所示，3200～3500cm-1處的寬峰是糖類分子內(nèi)或分子間O-H的伸縮振動(dòng)峰，說明果膠分子中或分子間有大量的-OH存在，該峰出現(xiàn)在3480cm-1附近，說明存在著明顯的分子間氫鍵;同時(shí)，在2938cm-1出現(xiàn)的吸收峰是糖類C-H伸縮振動(dòng)峰;1780cm-1處的峰是C=O的伸縮振動(dòng)峰，說明果膠中有乙?；嬖?而1650cm-1處的吸收峰是-CHO中 C=O的伸縮振動(dòng)峰;1440cm-1和1414cm-1處的峰是 C-O-C的平面彎曲振動(dòng)峰;1350cm-1和1330cm-1處的峰是O-H的彎曲振動(dòng)峰;1050～1140cm-1處的弱峰是不對稱的C-O-C伸縮振動(dòng)峰，表明有-O-CH3存在;而1000～1180cm-1的吸收峰1108cm-1和1018cm-1是吡喃型糖環(huán)的醚鍵和羥基的吸收峰;920cm-1附近的吸收峰是D-吡喃型葡萄糖的特征吸收峰。3300～3500cm-1(-NH2)處無雙峰出現(xiàn)說明無蛋白存在。

圖5 果膠的FTIR光譜圖Fig.5 FTIR spectrum of pectin

2.4 基本成分分析

本實(shí)驗(yàn)所得果膠產(chǎn)品的干燥減量、二氧化硫、酸不溶灰分、總半乳糖醛酸、酰胺化度和重金屬鉛的含量等均符合GB 25533-2010的要求，總半乳糖醛酸含量達(dá)到66.21%，高于GB 25533-2010中的規(guī)定。各項(xiàng)指標(biāo)如表3所示。

表3 果膠的理化性能指標(biāo)Table 3 Physico-chemical performance index of pectin

3 結(jié)論

采用超聲波聯(lián)合復(fù)合酶法提取柚皮果膠，將兩種獨(dú)立的提取方法協(xié)同使用，避免了因高溫對果膠類化合物結(jié)構(gòu)的破壞，能夠提高果膠的提取量與純度。同時(shí)，經(jīng)過優(yōu)化后的最佳工藝條件為:超聲波功率240W、超聲頻率24k Hz、超聲波處理時(shí)間20min、單次提取時(shí)間50min、緩沖液 p H5.5、酶提取溫度55℃、酶液用量0.9%，在此工藝條件下用酶提取3次，柚皮果膠的平均提取量為236.2mg/g。比在相同工藝條件下，常規(guī)水浴法的果膠提取量高22.8mg/g，且果膠純度較高，不含蛋白。

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