桑葉提取物抑菌活性及其成分分析

劉 凡，陳佳佳，，廖森泰，* ，孫遠(yuǎn)明，鄒宇曉，肖更生

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510610;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642)

桑葉為?？坡淙~喬木桑樹(Morus albaL.)的葉，栽培或野生。桑葉是中醫(yī)常用清熱解毒類藥材，主治熱感冒、肺熱燥咳、頭暈頭疼、目赤等癥，臨床應(yīng)用十分廣泛，常用桑葉入藥，組成復(fù)方中藥，療效良好［1］。近年來，對桑葉清熱解毒作用的研究日益增多，研究方向主要集中在抑菌作用［2］、抗病毒作用［3］、增強(qiáng)免疫功能［4］、抗炎作用、抗內(nèi)毒素和抗過氧化損傷等方面［5］。抑菌作用作為清熱解毒作用的最初靶點(diǎn)，引起人們的廣泛關(guān)注。因此，從抑菌作用的角度來探討桑葉的清熱解毒作用具有重要意義。研究表明鮮桑葉水浸出液［6］、干桑葉乙醇提取物浸膏［7］以及干桑葉水提物［8］對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有抑制作用。梁薇等［9］研究表明桑葉水提物及醇提物均對金黃色葡萄球菌有較明顯抑菌及殺菌作用。本課題組對桑葉不同溶劑提取物的抑菌活性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)70%乙醇提取物對金黃色葡萄球菌等5種供試菌的抑制作用最強(qiáng)［10］。本實(shí)驗(yàn)在前期對桑葉粗提物抑菌活性研究的工作基礎(chǔ)上，對桑葉粗提物進(jìn)行極性分段，采用微量稀釋法對四個(gè)極性部位進(jìn)行抑菌活性的測試，得到抑菌活性最優(yōu)的部位，再應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)對活性部位進(jìn)行成分分析，為闡明桑葉提取物抑菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葉 2011年6月采自國家桑樹種質(zhì)資源華南分圃(廣州)，桑葉洗凈后于50℃下烘干，粉碎，過60目篩，得桑葉粉末備用;金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella spp.)、普通變形桿菌(Proteus vulgaris)廣東省微生物菌種保藏中心;碘硝基四唑紫 INT，AMRESCO公司;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基;二甲基亞砜 DMSO，AMRESCO公司;石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇 均為國產(chǎn)分析純。

表1 桑葉粗提物各萃取部位的最低抑菌濃度(MIC值)(n=3)Table 1 MICof different extractions from Mulberry leaf crude extract(n=3)

Agilent 6890GC/5973MC氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀安捷倫科技有限公司;HZQ-QX型恒溫振蕩器哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;FA2004N精密電子天平 賽多利斯公司;超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SPX-250B生化培養(yǎng)箱 上海佳勝實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀日本東京理化株式會(huì)社;蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 桑葉粗提物的極性分段 稱取桑葉粉末200.0g，以1∶20的料液比加入70%乙醇溶液，于40℃恒溫水浴浸提24h，過濾，收集濾液［10］。濾液于40℃減壓濃縮，得到70%乙醇提取物浸膏。浸膏加水分散后，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，重復(fù)4次，合并相同萃取液。各萃取液減壓濃縮分別得到石油醚部位浸膏2.70g，乙酸乙酯部位浸膏5.60g，正丁醇部位浸膏3.30g，水部位浸膏9.10g，溶劑揮發(fā)后冷凍干燥，備用。

1.2.2 各萃取部位最小抑菌濃度(MIC)的測定 采用微量稀釋法，參考Mathabe MC等［11］的方法稍作修改，以二甲亞砜(DMSO)為溶劑，將桑葉各萃取部位配制一系列梯度濃度的樣品溶液，待用。在96孔板中，每孔加入160μL營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，從A～G行依次加入一系列梯度濃度的樣品溶液20μL，混勻。H行加入DMSO，作為對照。用無菌移液槍吸取稀釋的菌液(1.5×106CFU/mL)20μL加入各孔，每孔總體積為200μL。培養(yǎng)板在37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h后，將顯色劑碘硝基四唑紫(INT)20μL加入各孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，觀察其顏色變化。每一濃度梯度做3組平行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。

1.2.3 桑葉石油醚萃取部位的氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)分析

1.2.3.1 樣品制備 準(zhǔn)確稱取石油醚萃取物，用石油醚溶解，配成1mg/mL的溶液，溶液經(jīng)0.22μm孔徑的濾膜過濾除菌，用于GC-MS分析。

1.2.3.2 GC-MS條件 色譜柱規(guī)格:DB-5 MS，30mm×0.25mm，0.25μm。氣相色譜操作條件:自動(dòng)進(jìn)樣，進(jìn)樣量1μL;進(jìn)樣口不分流模式;進(jìn)樣口溫度260℃;載氣He，載氣為恒流模式，柱流速1.0mL/min，平均線速為37cm/sec。升溫程序?yàn)?初始溫度120℃，保持2min，以15℃/min升至240℃，保持15min，共計(jì)25min。質(zhì)譜條件:質(zhì)譜電離能量 70eV，電子倍增管電壓2164V，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，掃描范圍 10～450m/z。

1.2.3.3 GC-MS分析 石油醚萃取部位經(jīng)GC-MS檢測，通過Agilent化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，檢索NIST譜圖庫，并結(jié)合人工譜圖解析及文獻(xiàn)對比，確定樣品各種化學(xué)成分，以面積歸一化法測得各組分的相對含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 各萃取部位的抑菌活性

采用微量稀釋法，測定各萃取部位的最小抑菌濃度(MIC)，結(jié)果見表1。

由表1可知，石油醚部位具有很強(qiáng)的抑菌活性，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和普通變形桿菌的最小抑菌濃度，達(dá)到0.312mg/mL，遠(yuǎn)強(qiáng)于桑葉粗提物的抑制效果(MIC為2.50mg/mL)，說明經(jīng)過萃取分離，桑葉中的活性物質(zhì)得到了富集。乙酸乙酯部位對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有強(qiáng)抑制活性，但對大腸桿菌、沙門氏菌和普通變形桿菌抑制效果不明顯。正丁醇部位和水部位對所有供試細(xì)菌都沒有明顯的抑制效果。綜上可知，石油醚萃取部位的抑菌活性最好。石油醚部位多為脂溶性和揮發(fā)性組分，因此采用GC-MS法對其進(jìn)行成分分析。

2.2 桑葉石油醚萃取部位的GC－MS分析

GC-MS檢測，得到桑葉粗提物石油醚萃取部位的總離子流色譜圖，見圖1。

從桑葉石油醚萃取部位中共分離出27個(gè)峰，經(jīng)NIST譜庫對照、人工譜圖解析并結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)，確認(rèn)了其中的16個(gè)化學(xué)成分，以面積歸一化法測得各組分的相對含量，已鑒定的化合物占總峰面積的88.32%，結(jié)果見表2。

由表2可知，桑葉石油醚萃取部位主要成分為:9種脂肪酸類化合物占被測總量40.76%;2種醇類化合物占被測總量25.72%;2種長鏈烷烴類占被測總量20.12%。其中植物醇的含量最高，為24.87%;其次為環(huán)二十八烷(18.00%)、棕櫚酸(10.20%)、α-亞麻酸(9.06%)、亞麻酸乙酯(7.92%)、硬脂酸(7.14%)。此外，桑葉石油醚萃取部位還含有少量α-生育酚、β-谷甾醇等活性成分。

表2 桑葉粗提物石油醚萃取部位的化學(xué)成分及相對含量Table 2 The chemical composition and relative content of petroleum ether extraction

圖1 桑葉粗提物石油醚部位的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of petroleum ether extraction from Mulberry leaf crude extract

劉志明等［12］對桑葉正己烷提取物中揮發(fā)性組分進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析，結(jié)果表明桑葉正己烷提取物的主要揮發(fā)性組分為十八烷、環(huán)二十八烷和棕櫚酸等。脂肪酸及其衍生物是天然、高效食品抑菌劑的重要來源。Huang等［13］研究了短、中、長鏈飽和脂肪酸對微生物的抑制作用，結(jié)果表明中長鏈脂肪酸(月桂酸，棕櫚酸)具有較好的抑菌活性。Zheng等［14］研究表明α-亞麻酸對金黃色葡萄球菌的MIC為0.4mg/mL，對化膿鏈球菌的MIC為0.1mg/mL，可見α-亞麻酸具有很好的抑菌活性。Sun等［15］比較了脂肪酸及其甘油單酯對幽門螺旋桿菌(慢性胃炎及胃潰瘍的致病菌)的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)油酸和亞麻酸是最有效的不飽和脂肪酸。張璐［16］比較脂肪酸及其衍生物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用，結(jié)果表明對金黃色葡萄球菌抑制最強(qiáng)的脂肪酸是α-亞麻酸，γ-亞麻酸次之，硬脂酸和油酸對金黃色葡萄球菌有抑制作用。蔣玲艷等［17］等報(bào)道茶油具有廣譜抗菌作用，用氣相色譜對茶油成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其主要含有5種脂肪酸，即油酸、棕櫚酸、亞油酸、硬脂酸和亞麻酸。此外，研究報(bào)道維生素E(α-生育酚)對幽門螺桿菌有抑制作用，并且此種抑制作用依賴于培養(yǎng)基的p H［18］。植物甾醇具有一定的抑菌效果，抑菌效能隨添加量的增加而增強(qiáng)［19］。

本實(shí)驗(yàn)中利用GC-MS測得桑葉石油醚萃取部還含有少量α-生育酚、β-谷甾醇等活性成分，可見α-生育酚和β-谷甾醇對石油醚萃取部的抑菌作用也有一定的貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

本文通過比較桑葉粗提物不同溶劑萃取部位的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)石油醚萃取部位具有較強(qiáng)的綜合抑菌活性，是桑葉70%乙醇提取物抑菌的主要活性部位。利用GC-MS技術(shù)測定石油醚萃取部位含有植物醇(24.87%)，環(huán)二十八烷(18.00%)，棕櫚酸(10.20%)，亞麻酸(9.06%)和硬脂酸(7.14%)。由于未見有關(guān)植物醇和環(huán)二十八烷抑菌活性的報(bào)道，因此推測棕櫚酸，α-亞麻酸和硬脂酸可能為桑葉抑菌活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

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