牛鼻栓三裂輪簇霉菌發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性研究

吳振瑩，方 玲，高 強，陳雙林

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京210023)

具有抗氧化作用的天然產(chǎn)物可用于藥品和食品中，對人體健康有重要作用［1］。國內(nèi)外對抗氧化天然成分的研究十分活躍，然而目前研究較多的黃酮類、多酚類、皂苷類和酶類等傳統(tǒng)的天然抗氧化物質(zhì)多來源于植物［2-3］。近年來，真菌的抗氧化活性研究日益受到重視［4］，表明真菌天然產(chǎn)物的抗氧化活性研究具有巨大潛力。植物內(nèi)生真菌是一類存在于健康植物體內(nèi)的微生物，種類和數(shù)量龐大，是具有新活性或新結(jié)構(gòu)的天然物質(zhì)的潛在資源庫，其中也包含天然的抗氧化活性產(chǎn)物［5-6］。牛鼻栓(Fortunearia sinensisRehd.et Wils.)是中國特有的一種金縷梅科(Hamamelidaceae)木本植物，其葉內(nèi)含有巖白菜內(nèi)酯和牛鼻栓苷，具有抗氧化活性［7］。基于植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次生代謝產(chǎn)物的原理［8］，我們試圖探尋具有較高抗氧化活性的牛鼻栓內(nèi)生真菌菌株，以便進一步開發(fā)其抗氧化天然產(chǎn)物。在前期研究中，利用總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒對從牛鼻栓葉片、葉柄、枝條和花中分離的60株內(nèi)生真菌發(fā)酵培養(yǎng)物的總抗氧化活性進行測定，從而篩選出了一株抗氧化活性較高的牛鼻栓內(nèi)生真菌菌株No.48，經(jīng)形態(tài)分類學(xué)鑒定該菌為三裂輪簇霉菌(Verticicladium trifidum)。本文研究了該菌的總抗氧化活性和體外對超氧陰離子自由基(O-2·)、羥自由基(·OH)、二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)的清除能力，為進一步研究和開發(fā)其具有抗氧化活性的天然產(chǎn)物奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種 采用總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒對分離自牛鼻栓健康組織的內(nèi)生真菌菌株的發(fā)酵液粗提物進行抗氧化活性的初測。其中，分離自枝條中的菌株No.48表現(xiàn)出明顯較高的抗氧化活性，被選作為本研究的供試菌株。根據(jù)其產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及菌落形態(tài)特征鑒定為三裂輪簇霉菌(Verticicladium trifidum)。菌種保存于南京師范大學(xué)生命科學(xué)院微生物實驗室，編號No.48。

蘆丁標準品 中國藥品生物制品檢定所;二苯基苦基苯肼(DPPH) 購自Sigma公司;總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒 南京建成生物工程公司;培養(yǎng)基 菌株分離、純化和保藏所用培養(yǎng)基均為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA);發(fā)酵培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB);其它試劑 均為國產(chǎn)分析純;所用水為超純水。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀產(chǎn)品RE-52AA 上海亞榮生化儀器廠;真空冷凍干燥機CT-DW110 購自Heto公司;紫外可見分光光度計UVmini-1240 日本島津公司。

1.2 發(fā)酵液提取物的制備

將活化后的菌株接種于PDB中，250mL三角瓶裝液量100mL，(26 ±1)℃、130r/min 搖床培養(yǎng)6d，真空抽濾除去菌絲體后獲得發(fā)酵液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至體積的1/10，加入適量95%乙醇沉淀后8000r/min離心10min，棄沉淀，上清液蒸去乙醇，濃縮至粘稠狀，冷凍干燥，得到粗提取物。

1.3 菌株培養(yǎng)液提取物的抗氧化活性測定

1.3.1 抗氧化活性的測定 采用鐵氰化鉀還原力測定法，參照Yang等［9］的方法并加以改進。取1.2中所得發(fā)酵液粗提物，以超純水溶解制成質(zhì)量濃度為1.0mg/mL的樣品溶液，稀釋并精確移取不同質(zhì)量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)的樣品溶液 1mL，加入磷酸緩沖液(0.2mol/L，pH6.6)2.5mL和30mmol/L的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合物50℃下水浴20min。再加入 0.6mol/L三氯乙酸 2.5mL，均勻混合后，3000r/min離心10min。吸取2.5mL上清液，加入超純水2.5mL和6mmol/L的FeCl3溶液0.5mL，均勻混合，在700nm處測定其吸光度。同時以相應(yīng)濃度的蘆丁溶液作陽性對照，超純水作空白對照。

1.3.2 抗氧化活性穩(wěn)定性的測定 采用碘量法［10］來評價牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌(V.trifidumNo.48)發(fā)酵液提取物的抗氧化活性穩(wěn)定性。精確稱取相當(dāng)于豬油質(zhì)量的0.01%、0.02%、0.04%、0.06%的發(fā)酵液提取物，分別放入100mL錐形瓶中，加入少許超純水溶解，然后分別加入一定量的豬油，攪拌均勻，同時設(shè)置空白對照和陽性對照，其中空白對照以相應(yīng)體積的超純水代替待測樣品，陽性對照以0.04%的蘆丁代替樣品。將所有試樣放入(58±1)℃的烘箱中強化保存，每隔24h攪拌一次，并測定其過氧化值。每組處理均做3個重復(fù)。過氧化值的測定:按照GB5009.37-2003測定。

1.4 菌株培養(yǎng)液提取物自由基清除能力測定

1.4.1 超氧陰離子自由基(O2-·)清除能力的測定采用鄰苯三酚自氧化法，參照Furuno等［11］的方法并加以改進。取0.05mol/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液4.5mL，置25℃水浴20min，加入不同質(zhì)量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)的樣品溶液 0.1mL，再加入2.5mmol/L的鄰苯三酚0.4mL，混合后25℃水浴反應(yīng)4min，立即用 8mol/L的 HCl 0.1mL終止反應(yīng)，在299nm處測定吸光值。0.1mL的超純水代替樣品作為對照組，以0.5mL超純水代替樣本溶液和鄰苯三酚作為空白組。同時，以相應(yīng)濃度的蘆丁溶液作對照實驗，每組均做3個重復(fù)。

清除率按下式計算:

清除率(%)=［A1-(A0-A10)］/A1×100

式中，A1為對照組的吸光值;A0為樣品組及蘆丁組的吸光值;A10為空白組的吸光值。

1.4.2 羥基自由基(·OH)清除能力的測定 根據(jù)Fenton反應(yīng)，采用亞甲基藍光度法，參照Strobel等［12］的方法，并加以改進。在25mL容量瓶中加入0.15mmol/L亞甲基藍溶液2.0mL，磷酸緩沖液2.5mL(0.1mol/L p H7.0)，0.01mol/L FeSO4溶液 1.0mL，不同質(zhì)量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)的樣品和蘆丁溶液各1.0mL，7.5mmol/L H2O2400μL，最后加超純水稀釋至總體積為25mL，室溫放置10min后于660nm處測定吸光值，每組均設(shè)3個重復(fù)。

清除率按下式計算:

清除率(%)=［1-(A0-A2)/(A0-A1)］×100

式中，A0為初始亞甲基藍溶液的吸光值;A1為加入Fenton試劑后吸光值;A2為加入樣品及Fenton試劑反應(yīng)后的吸光值。

1.4.3 清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)能力的測定 參照 Molyneux［13］和曾培源等［14］的方法，并加以改進。用75%乙醇配制0.2mmol/L的DPPH溶液。在10mL的具塞試管中加入2mL DPPH溶液和2mL 不同質(zhì)量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)的樣品溶液混合均勻，室溫下暗處放置30min反應(yīng)，517nm處測定吸光值。同時以相應(yīng)濃度的蘆丁作為對照，每組均做3個重復(fù)。清除率按下式計算:

清除率(%)=［1-(A0-A1)/A10］×100

式中，A0為2mL DPPH溶液+2mL樣品溶液的吸光值;A1為2mL樣品溶液+2mL乙醇的吸光值;A10為2mL DPPH溶液+2mL乙醇的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌發(fā)酵液提取物的抗氧化能力

圖1中鐵氰化鉀法測定菌株發(fā)酵液提取物的相對還原力表明，0.2～1.0mg/mL濃度范圍內(nèi)，牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌(V.trifidum)菌株No.48發(fā)酵液提取物的還原力隨濃度的增加而逐漸增加，當(dāng)濃度達到1.0mg/mL吸光度達到最大為0.922。牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌菌株No.48發(fā)酵液提取物的抗氧化活性顯著地高于相應(yīng)濃度的蘆丁。

圖1 牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌發(fā)酵液提取物的抗氧化能力Fig.1 Relative reducing power of the extracts of strain No.48 of endophytic Verticicladium trifidum isolated from twig of Fortunearia sinensis

2.2 牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌發(fā)酵液提取物抗氧化作用的穩(wěn)定性

應(yīng)用碘量法測定了不同濃度的牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌(V.trifidum)No.48發(fā)酵液提取物對豬油脂質(zhì)過氧化的抑制能力在反應(yīng)進行10d中的動態(tài)變化，過氧化值(POV)越低，抑制能力越強［15］。圖2表明，不同濃度的供試菌發(fā)酵液提取物和蘆丁最初幾天的抗氧化能力差異并不大，各濃度處理的油樣的過氧化值都低于空白對照，表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。隨著反應(yīng)的進行，從第6d起，0.01%和0.02%組的過氧化值雖仍低于空白，但其過氧化值增長速度明顯快，可見油脂自發(fā)氧化的自由基連鎖反應(yīng)已經(jīng)開始較快地進行［16］，抗氧化作用迅速減弱。但是，0.04%和0.06%濃度卻一直保持著較穩(wěn)定的抗氧化活性，至反應(yīng)終了的第10d，過氧化值仍分別僅為2.01和1.54meg/kg，遠低于陽性對照蘆丁的12.57meq/kg。

圖2 牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌發(fā)酵液提取物與蘆丁處理豬油的過氧化值的動態(tài)變化Fig.2 Changing trend of POV of lard coped with the extracts of strain No.48 of endophytic Verticicladium trifidum isolated from leaves of Fortunearia sinensis and rutin

2.3 牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌發(fā)酵液提取物對O－·的清除作用2

由圖3可知，牛鼻栓三裂輪簇霉菌(V.trifidum)No.48發(fā)酵液提取物對鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O2-·具有較強的清除能力，且清除率隨著濃度的增加而增大。濃度為1.0mg/mL時，清除率可達84.25%。除濃度0.2mg/mL時，蘆丁的清除率稍大于相應(yīng)濃度的發(fā)酵液提取物。在0.4～1.0mg/mL濃度范圍內(nèi)，其發(fā)酵液提取物對超氧陰離子自由基的清除率均高于同等濃度的蘆丁。

圖3 牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌發(fā)酵液提取物對O2-·的清除作用Fig.3 Scavenging effect on O2-·generated by pyrogallicacid

2.4 牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌發(fā)酵液提取物對·OH的清除作用

采用亞甲基藍光度法測定清除羥基自由基的能力，由圖4可知，在0.2～1.0mg/mL濃度范圍內(nèi)牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌(V.trifidum)No.48發(fā)酵液提取物和蘆丁清除羥基自由基的能力均隨著濃度的增加而增大。盡管發(fā)酵液提取物對羥基自由基的清除作用均低于相應(yīng)濃度的蘆丁，但當(dāng)濃度為1.0mg/mL時牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌(V.trifidum)No.48發(fā)酵液提取物對羥基自由基的清除率達到最大為74.12%，亦表現(xiàn)出較強的清除作用。

圖4 牛鼻栓三裂輪簇霉菌發(fā)酵液提取物對Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH的清除作用Fig.4 Scavenging effect on·OH generated by the reaction of Fenton

2.5 牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌發(fā)酵液提取物對DPPH·的清除作用

DPPH·是一種很穩(wěn)定有機自由基，牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌(V.trifidum)No.48發(fā)酵液提取物作用于其的結(jié)果表明，在0.2～0.8mg/mL濃度范圍內(nèi)，清除DPPH自由基的能力隨著濃度的增加而增大，且均稍低于同等濃度的蘆丁。當(dāng)濃度增加到1.0mg/mL時，清除率達到最高，為84.27%，高于同等濃度的蘆丁(見圖5)。

3 討論

圖5 牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌發(fā)酵液提取物對DPPH·的清除率Fig.5 Scavenging effect on the free radical of DPPH·

利用T-AOC試劑盒對分離自牛鼻栓各健康組織中的內(nèi)生真菌發(fā)酵液提取物進行了抗氧化活性的初步測定，篩選出的三裂輪簇霉菌(Verticicladium trifidum)No.48具有相對較高的總抗氧化活性。本研究采用鐵氰化鉀還原力測定法和碘量法測定的相對還原力和過氧化值兩個指標都顯示其具有較高的抗氧化活性。此外，添加量為0.04%和0.06%濃度的發(fā)酵液提取物處理豬油數(shù)日，均具有較低的過氧化值，可以說明在1～10d范圍內(nèi)，該菌株發(fā)酵液提取物能夠保持良好的抗氧化活性比較穩(wěn)定。這也暗示其中可能含有供氫能力較強的物質(zhì)，能有效地抑制油脂自發(fā)氧化的自由基連鎖反應(yīng)的進行。

相對還原力和過氧化值兩個指標均顯示牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌(V.trifidum)No.48發(fā)酵產(chǎn)物的總抗氧化活力高于蘆丁，而且從清除超氧陰離子自由基(O2-·)、羥自由基(·OH)和二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)的情況來看，該菌發(fā)酵液提取物對O2-·和DPPH·均具有較強的清除作用，清除能力優(yōu)于蘆丁，1.0mg/mL濃度下，清除率分別達到84.25%和84.27%;雖對·OH的清除作用弱于蘆丁，但濃度為1.0mg/mL時，清除率亦可達到74.12%。由此，可以認為該菌所表現(xiàn)出來的顯著高于蘆丁的總抗氧化活性是由對多種自由基清除的綜合作用決定的，而不是由于清除其中一種自由基主導(dǎo)了抗氧化活性，其作用機理較為復(fù)雜。

三裂輪簇霉菌(V.trifidum)此前作為腐生真菌在國內(nèi)外被報道［17-18］，主要分布在土壤、植物殘體和一些食草動物糞便等基物中。但是，眾多植物內(nèi)生真菌多樣性研究表明［19-20］，大量的腐生性真菌是植物內(nèi)生真菌的重要組成部分，而且具有重要的生態(tài)價值［21］。因此，三裂輪簇霉菌V.trifidum作為內(nèi)生真菌從牛鼻栓植株的健康枝條中被分離獲得，暗示著該菌能夠以非腐生的方式存在，并且植物活體內(nèi)的輪簇霉菌可能具有不同于腐生輪簇霉菌的生物活性。牛鼻栓是牛鼻栓苷和巖白菜素的一種藥源植物，而且?guī)r白菜素具有一定的抗氧化活性［22］，基于“植物內(nèi)生真菌一般可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的化學(xué)成分”的觀點［8］，對本研究中具有較高抗氧化活性的牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌V.trifidum菌株No.48的深入研究，有望實現(xiàn)其用于開發(fā)天然抗氧化物質(zhì)的潛在價值。

4 結(jié)論

本文通過對牛鼻栓內(nèi)生三裂輪簇霉菌發(fā)酵液提取物的相對還原力、抗脂質(zhì)過氧化穩(wěn)定性以及自由基清除能力的測定，可以得出如下結(jié)論:牛鼻栓內(nèi)生真菌三裂輪簇霉菌株No.48表現(xiàn)出的這種較高的抗氧化能力及良好的穩(wěn)定性且優(yōu)于陽性對照蘆丁，可以認為是對O-2·、·OH和DPPH· 等多種自由基清除的綜合作用決定的，而不是由于清除其中一種自由基主導(dǎo)了抗氧化活性。牛鼻栓內(nèi)生三裂輪簇霉菌表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，有望作為具有天然抗氧化活性的新的微生物資源進行深入研發(fā)。

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