具備高同型半胱氨酸血癥的實驗性結(jié)腸炎模型的建立

丁 浩，梅 俏，劉曉昌，曹立宇，甘惠中，許建明

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽省消化病重點實驗室，安徽合肥 230032)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一種含硫氨基酸，是甲硫氨酸去甲基化過程中的中間產(chǎn)物。Hcy可造成細胞氧化損傷，引起炎癥介質(zhì)釋放、刺激血管平滑肌增殖、干擾脂質(zhì)代謝等［1］。高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHcy)是心腦血管疾病、終末期腎病等多種疾病的危險因素［2］，降低血漿Hcy水平對心血管和腎臟疾病能起到預(yù)防和治療作用［3］。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，是病因尚未明確的慢性非特異性腸道炎癥性疾病。研究表明IBD患者血漿和結(jié)腸粘膜組織中存在Hcy水平增高［4］，但此現(xiàn)象與IBD腸粘膜損傷的具體關(guān)系尚不十分明確。因此，本研究擬建立一種具備HHcy特征的實驗性結(jié)腸炎模型，有助于探討Hcy與結(jié)腸炎的相互關(guān)系及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 SD大鼠，SPF級，♂，體質(zhì)量200 g±20 g，購于安徽省動物中心。TNBS(031M5021)、DL-同型半胱氨酸(MW 135.18，121M39044)均購自美國Sigma公司。髓過氧化物酶(MPO)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗分組 每組8只大鼠。在室溫，光照周期12 h∶12 h條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后使用。

A組:正常對照組，生理鹽水灌腸1次后，每天皮下注射生理鹽水，每天2次，間隔8 h，連續(xù)30 d;B組:正常對照+Hcy注射組，生理鹽水灌腸1次后，每天皮下注射Hcy，0.03 μmol·kg－1，每天2 次，間隔8 h，連續(xù)30 d;C 組:TNBS 模型對照組，TNBS/乙醇混合溶液灌腸1次后，每天皮下注射生理鹽水，每天2次，間隔8 h，連續(xù)30 d;D組:TNBS模型+Hcy注射組，TNBS/乙醇混合溶液灌腸1次后，每天皮下注射Hcy，0.03 μmol·kg－1，每天 2 次，間隔 8 h，連續(xù) 30 d。

1.3 模型制備和給藥方法

1.3.1 結(jié)腸炎模型制備 參照文獻方法［5］，造模前24 h禁食不禁水，10%水合氯醛(250 mg·kg－1)腹腔注射麻醉，用橡膠管經(jīng)肛門插入大鼠結(jié)腸內(nèi)8 cm左右，注入以等體積乙醇溶解的TNBS(100 mg·kg－1)溶液。對照組灌腸等體積生理鹽水。

1.3.2 高同型半胱氨酸血癥模型制備 參照文獻方法［6］，DL-Hcy溶于0.9%NS，滴定pH至7.4，皮下注射Hcy(0.03 μmol·g－1)，每天2 次，間隔 8 h，連續(xù) 30 d。對照組皮下注射等體積生理鹽水。

1.4 標本采集 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，采血以3 000 r·min－1離心10 min，取上清保存于－80℃。切取遠端結(jié)腸約8 cm，沿縱軸剪開腸管，冰生理鹽水沖洗干凈，取部分結(jié)腸行HE染色及勻漿檢測。

1.5 檢測方法

1.5.1 大鼠血漿和結(jié)腸組織Hcy水平檢測 采用HPLC-FD方法［7］檢測。取血漿和結(jié)腸組織勻漿100 μl，加入丁基膦10 μl，混勻后于4℃反應(yīng)30 min;加入10%三氯醋酸100 μl混勻后置于室溫10 min;13 000 r·min－1離心10 min;取上清液50 μl于試管內(nèi)，依次加入1.55 mol·L－1NaOH 10 μl，硼酸緩沖液 125 μl，熒光試劑 SBD-F 50 μl，混勻后置于 60℃ 水浴 60 min。取20 μl進樣分析。色譜條件:18C色譜柱，柱溫為室溫，流動相A液為乙腈、B液為磷酸鹽緩沖液.流速為0.4 m·min－1，激發(fā)波長為385 nm，發(fā)射波長為515 nm。

1.5.2 疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分 實驗過程中每日觀察大鼠體重變化和大便性狀，并且每日觀察或用糞便隱血試紙檢測大便帶血情況，按文獻方法［8］行DAI評分。

1.5.3 大鼠結(jié)腸病理檢查 取病變明顯腸段，10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片(4 μm)，HE染色，顯微鏡下觀察炎癥情況，參照文獻［9］行病理組織學(xué)評分(histological index，HI)。

1.5.4 結(jié)腸勻漿MPO活性檢測 取結(jié)腸組織制備10%結(jié)腸組織勻漿，按說明書要求測定各樣本吸光度(A)值，計算MPO活性。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血漿和結(jié)腸粘膜Hcy水平比較 與A組比較，B組大鼠血漿和結(jié)腸粘膜 Hcy水平明顯增高(P＜0.01)。與C組比較，D組大鼠血漿和結(jié)腸粘膜Hcy水平明顯增高(P＜0.01)，見Tab 1。

Tab 1 Levels of Hcy in plasma and colon mucosa after chronic administration

2.2 Hcy對TNBS結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸損傷的影響 與A組比較，C組和D組大鼠體重明顯減輕，出現(xiàn)不同程度的肉眼血便，DAI評分增高見Tab 2，結(jié)腸粘膜病理示結(jié)腸黏膜上皮細胞破壞，大量炎細胞浸潤，黏膜下層水腫見圖1，HI評分明顯增高(P＜0.01)，大鼠結(jié)腸勻漿中MPO活性明顯增高，見Tab 2。與C組比較，D組大鼠DAI評分和結(jié)腸粘膜病理損傷加重，HI評分和結(jié)腸勻漿MPO活性增高(P＜0.01)見Tab 1，F(xiàn)ig 1。

Tab 2 Effect of Hcy on DAI and HI scoring and MPO activity in the TNBS-induced colitis rats

Fig 1 Histopathologic features of the colon in association with colitis(HE×40)

3 討論

TNBS是一種半抗原，在乙醇破壞腸黏膜屏障后，TNBS滲入結(jié)腸與大分子物質(zhì)結(jié)合為完全抗原，引起結(jié)腸炎。這種結(jié)腸炎模型廣泛用于炎癥性腸病的研究。本實驗中，采用TNBS/乙醇灌腸后，大鼠出現(xiàn)明顯的大便性狀改變和體重下降，HI評分和結(jié)腸組織MPO活性增高，表明TNBS結(jié)腸炎模型制備成功。

多項研究結(jié)果顯示，IBD患者血漿和結(jié)腸黏膜組織Hcy水平明顯高于對照組，可能與血漿葉酸、VitB12、VitB6水平降低以及 Hcy代謝酶基因多態(tài)性有關(guān)［7，10］。本文可見到TNBS結(jié)腸炎大鼠血漿和結(jié)腸組織Hcy水平增高，可能與腹瀉引起包括維生素類等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收障礙有關(guān)。

Hcy可通過氧化損傷破壞細胞結(jié)構(gòu)和功能;促進釋放多種炎性介質(zhì)(NF-κB、IL-6、IL-1β等)加重組織炎癥損傷;刺激血管平滑肌細胞增殖，增加膠原生成和沉積，參與血管重塑［4］;引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)引起腸黏膜上皮炎癥狀態(tài)［11］。在有關(guān)Hcy與心腦血管疾病的研究中，采用高蛋氨酸［12］或Hcy 飲食［13］、皮下注射 Hcy［6］、胱硫醚-β-合成酶(CBS)基因敲除［14］等多種方法制備HHcy模型。高蛋氨酸或Hcy飲食造成的HHcy模型與大鼠體重變化相關(guān)，因大鼠對富含蛋氨酸或Hcy飼料或飲水的攝入量不穩(wěn)定［15］。選擇CBS基因敲除大鼠可制備較穩(wěn)定HHcy模型，但由于費用高昂未能被廣泛應(yīng)用。采用皮下注射Hcy造成的慢性輕度HHcy模型類似于人類心腦血管等疾病中Hcy水平，不依賴于大鼠攝食或飲水，穩(wěn)定性較好［6］。通過以上方法建立的HHcy模型為研究心腦血管疾病的發(fā)病機制和藥物防治起到重要作用。但由于缺乏具備HHcy特征的結(jié)腸炎模型，Hcy是否參與IBD結(jié)腸黏膜病理損傷及其機制尚未明確。因此，本研究擬通過聯(lián)合TNBS/乙醇灌腸及皮下注射Hcy制備一種具備HHcy的實驗性結(jié)腸炎模型。

在本研究中，通過連續(xù)30 d皮下注射Hcy，大鼠血漿和結(jié)腸粘膜組織Hcy均明顯增高，表明HHcy模型制備成功。與TNBS模型對照組比較，同時采用皮下注射Hcy的結(jié)腸炎大鼠DAI和HI評分增高，結(jié)腸組織MPO活性增高，提示HHcy加重結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸炎癥損傷。具備高同型半胱氨酸血癥特征的實驗性結(jié)腸炎模型的成功建立，初步證實Hcy可加重結(jié)腸炎癥損傷，為Hcy與結(jié)腸炎病理損傷關(guān)系及其機制的進一步研究提供實驗依據(jù)。

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