氫溴酸檳榔堿對(duì)幽門螺桿菌生長和空泡毒素A表達(dá)和活性的影響

劉 丹，廖順花，王莉新，王 易

(上海中醫(yī)藥大學(xué)免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室，上海 201203)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)的致病性與其分泌的多種毒力因子有關(guān)，包括:尿素酶(Ure)、鞭毛蛋白(Fla)、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(cytotoxin associated gene A，CagA)和空泡毒素A(vacuolating cytotoxin，VacA)等。其中VacA是一種單獨(dú)作用即可引起靶細(xì)胞發(fā)生空泡化、凋亡、骨架重排等病理改變，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡的毒性蛋白，與胃、十二指腸的炎癥性疾病密切相關(guān)［1］。已有資料顯示并非全部的H.pylori都具有致病性，那些缺乏毒力因子(如VacA和CagA等)的細(xì)胞株常常是低毒株或無毒株，而不具有致病性［2］。且有文獻(xiàn)報(bào)道，經(jīng)藥物治療的H.pylori感染人群，其食管癌發(fā)病率增高(源于返流性食管炎的增加)，提示非致病的H.pylori可能是人體潛在的正常菌群，完全清除并非善策［3－4］。故尋找非抗生素的其他治療策略或成為必要。

檳榔、大腹皮是臨床治療慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍等消化道疾?。?］的常用中藥。氫溴酸檳榔堿(arecoline hydrobromide，AH)是此兩味中藥的主要藥理成分［6］。臨床使用雖不能獲得類似西藥二聯(lián)、三聯(lián)和四聯(lián)等方案聯(lián)合使用的根除效果。但對(duì)癥狀的緩解與改善卻十分肯定［7］。為解釋這一現(xiàn)象。本研究提出了中藥在非殺菌劑量下，可能通過抑制H.pylori毒力因子的形成與分泌來下調(diào)其毒性效應(yīng)的設(shè)想，故選擇VacA作為所選中藥成分氫溴酸檳榔堿的主要實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在體外實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 菌株、細(xì)胞株及中藥 H.pylori國際標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637購自于上海消化疾病研究所。胃癌細(xì)胞株BGC-823由上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院贈(zèng)送。中藥活性成分氫溴酸檳榔堿購自Sigma公司。

1.2 培養(yǎng)基 混合抗生素:多粘菌素B(polymyxin B Sulfate)(Amerisco)2.5 ×107U· L－1，兩性霉素B(Amphotericin B)(Amerisco)5 g· L－1，萬古霉素(Vancomycin HCl)(Amerisco)10 g· L－1，磺胺增效劑(上海日初)5 g· L－1。混合抗生素添加于培養(yǎng)基中，用于抑制其它雜菌的污染，同時(shí)可為H.pylori生長提供所需的胸腺嘧啶脫氧核苷［8］。

哥倫比亞固體培養(yǎng)基:哥倫比亞瓊脂(Columbia Agar Base，CAB)(上海日初)39 g· L－1，1‰ (V/V)混合抗生素，10%(V/V)脫纖維羊血(上海青陽)。腦心浸液液體培養(yǎng)基:腦心浸液培養(yǎng)基(上海日初)39 g· L－1，1‰ (V/V)混合抗生素。

1.3 H.pylori的培養(yǎng)和鑒定 H.pylori菌株的固體培養(yǎng):將菌株接種于上述哥倫比亞瓊脂固體培養(yǎng)基上，L型棒均勻涂布，透明膠帶固定后放于充氣罐內(nèi)充入混合氣體(85%N2、10%CO2、5%O2)，37℃恒溫培養(yǎng)，更換氣體每天1次，3～5 d后進(jìn)行菌種鑒定。取對(duì)數(shù)期細(xì)菌，經(jīng)無菌 PBS洗滌后，測(cè)其OD600nm值，1OD 細(xì)菌濃度相當(dāng)于 1 ×1011· L－1，調(diào)細(xì)菌濃度為1×109· L－1，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

H.pylori菌株的液體培養(yǎng):刮取已培養(yǎng)48 h的H.pylori菌苔，混懸于1 ml無菌生理鹽水，吸取200 μl接種于4 ml含混合抗生素的腦心浸液液體培養(yǎng)基中，置入?yún)捬豕?，充入混合氣體，37℃ 100 r·min－1振蕩培養(yǎng)，每天更換氣體1次，待液體混濁后進(jìn)行鑒定。通過形態(tài)學(xué)和生化學(xué)方法加以鑒定，將具有典型菌落特征者進(jìn)行涂片和革蘭染色，油鏡觀察其典型形態(tài)特征，并進(jìn)行快速尿素酶試驗(yàn)、過氧化氫試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)等一系列生化學(xué)鑒定。

1.4 中藥活性成分對(duì) H.pylori最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定［9］

1.4.1 固體法 將50 g· L－1氫溴酸檳榔堿倍比稀釋成不同的濃度梯度，每濃度取1 ml于無菌培養(yǎng)皿中，再加入9 ml哥倫比亞瓊脂，使氫溴酸檳榔堿的終濃度為 5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08 g·L－1。取50 μl上述對(duì)數(shù)期的 H.pylori菌液接種于制備好的含藥固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3～5 d后觀察細(xì)菌的生長情況，每個(gè)濃度做3復(fù)板，無細(xì)菌生長的最小藥物濃度為MIC。

1.4.2 液體法 使用含混合抗生素的腦心浸液液體培養(yǎng)基對(duì)氫溴酸檳榔堿進(jìn)行倍比稀釋，使藥液終濃度與固體法一致，每個(gè)濃度做3復(fù)管，加入對(duì)數(shù)期菌液 100 μl，培養(yǎng)3 ～4 d 后，每管各取50 μl接種于不含中藥活性成分的哥倫比亞瓊脂固體培養(yǎng)基上，無細(xì)菌生長的最小濃度為MIC。

1.5 粗制VacA蛋白制備 將對(duì)數(shù)期細(xì)菌分別培養(yǎng)于含有0.15 g· L－1溴酸檳榔堿的液體培養(yǎng)基中，并設(shè)立不加藥物處理的對(duì)照組，每組3復(fù)管，培養(yǎng)至液體渾濁 (OD600=0.8)后，收集各組細(xì)菌菌液，按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行粗制VacA蛋白制備［10］，測(cè)蛋白濃度，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 VacA活性檢測(cè) 胃癌細(xì)胞BGC-823作為H.pylori分泌的VacA毒性作用的靶細(xì)胞，在本研究中用來評(píng)價(jià)VacA的細(xì)胞毒性效應(yīng)。BGC-823培養(yǎng)于含10%新生牛血清(Gibco)的RPMI 1640(Gibco)培養(yǎng)液中，對(duì)數(shù)期BGC-823細(xì)胞接種至24孔細(xì)胞板，1×105/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞貼壁并鋪滿大部分板底。根據(jù)文獻(xiàn)選擇1∶2毒素滴度，終體積1 ml，作用24 h［10］。分為 3 組:VacA 對(duì)照組加入上述未經(jīng)藥物處理的粗制VacA蛋白;AH處理組加入經(jīng)溴酸檳榔堿處理后的粗制VacA蛋白;細(xì)胞對(duì)照組加入不含VacA的細(xì)胞培養(yǎng)液1 ml。24 h后吸棄上清，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。每孔加入0.05%中性紅 PBS 溶液 200 μl，置室溫孵育 8 min，500 μl PBS洗3次，加入200 μl 75%酸化乙醇，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm 吸光值(A570)［10］。

1.7 半定量RT-PCR檢測(cè) 使用革蘭陰性細(xì)菌RNA提取試劑盒(OMEGA)進(jìn)行細(xì)菌RNA提取，測(cè)定各樣本的 OD260和 OD280，以定量 RNA濃度，OD260/OD280＞1.8可用于實(shí)驗(yàn)。用10 μg RNA樣本，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說明書操作。用5 μl cDNA作為模板，以gyrB為內(nèi)參，按照PCR Master Mix試劑(Fermentas)使用說明，分別用VacA和gyrB引物，使用PCR Master Mix試劑(Fermentas)進(jìn)行PCR檢測(cè)，分析VacA mRNA表達(dá)水平，VacA引物為 F 5'-CAATCTGTCCAA TCAAGCGAG-3'，R 5'-GCGTCTAAATAATTCCAAGG-3'，產(chǎn)物長度 570bp。gyrB引物為 F 5'-CGCTAAAGAAAGTGGCACGAC-3'，R 5'-TGCGCGTTTCTTC ATCCAT-3'，產(chǎn)物長度265bp。反應(yīng)條件為:94℃ 5 min預(yù)變性;94℃ 15 s，55℃ 30 s(gyrB)/52℃ 30 s(vacA)，72℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)(gyrB)/40 個(gè)循環(huán)(vacA);72℃ 7 min延伸。5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，80V恒壓電泳30 min。用GBOX CHEMI圖像分析系統(tǒng)采集圖像，并使用smartview軟件讀取密度值。結(jié)果用目的基因/gyrB密度值表示。

1.8 細(xì)菌菌體蛋白和分泌蛋白樣本的制備 菌體蛋白制備:收集含藥物固體培養(yǎng)基上的細(xì)菌，PBS洗3次，沉淀加入1 ml細(xì)菌裂解液(8 mol· L－1脲素、4%CHAPS、1%pharmalyte(pH 3 ～10)、1%蛋白酶抑制劑混合物，用前加1%DTT。)懸浮。采用300W超聲粉碎細(xì)菌(工作10 s，間隔10 s)直至上清變清澈。4℃ 12 000 r·min－1離心 40 min，取上清。用考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒(南京建成)定量蛋白濃度，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

分泌蛋白制備:收集在含藥物液體培養(yǎng)基中生長的細(xì)菌，將其高速離心，0.22 μm濾膜過濾，上清加入10%1 mol· L－1三氯乙酸，4℃放置3 h以上，直至看到沉淀。4℃ 80 000 r·min－1離心20 min，棄上清，沉淀加入1 ml丙酮洗滌3次，空氣中自然干燥。沉淀蛋白加入細(xì)菌裂解液溶解，定量蛋白濃度，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 Western blot 取50 μg總蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，10%分離膠20 mA 15 min，3%堆積膠10 mA 1 h，200 mA 50 min轉(zhuǎn)膜，TTBS(100 mmol· L－1Tris-HCI，0.9%(W/V)NaCl，0.1%(V/V)Tween 20，pH 7.5)5 min洗3次，以5%脫脂奶粉TTBS封閉，常溫震蕩1 h。分別加入1∶250 VacA單抗(Santa Cruz)或1∶500 GAPDH單抗(Santa Cruz)，4℃孵育過夜，TTBS洗 3次，加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記二抗 (上海聯(lián)科)，RT震蕩1 h，TTBS 5 min洗3次，去除未結(jié)合二抗。取等量ECL發(fā)光劑(A液、B液各1 ml)混勻，浸膜3～5 min，曝光后顯影 5～60 s，定影 2 min。用 GBOX CHEMI圖像分析系統(tǒng)采集圖像，并使用smartview軟件讀取密度值。菌體蛋白中空泡毒素A的表達(dá)以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果用目的蛋白/GAPDH密度值之比表示，上清中空泡毒素A的表達(dá)直接以目的蛋白密度值表示。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 13.0專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，各試驗(yàn)組與對(duì)照組間差異性采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌鑒定 肉眼可見直徑約為0.2～1.0 mm的圓形、半透明或透明的灰白色或無色的針尖樣細(xì)小菌落，典型菌落經(jīng)革蘭染色后，油鏡下可見革蘭陰性、弧形、S形或海鷗展翅狀的典型形態(tài)，可判定為H.pylori(Fig 1)。進(jìn)一步生化學(xué)鑒定顯示，快速尿素酶試驗(yàn)、氧化氫試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)均陽性者可確認(rèn)為 H.pylori菌株［11］。

Fig 1 Morph of H.pylori observed by high power with staining of Gram

2.2 中藥活性成分對(duì)H.pylori生長具有抑制作用 本研究首先使用平皿稀釋固體法和腦心浸液液體法測(cè)定中藥活性成分氫溴酸檳榔堿對(duì)H.pylori的最低抑菌濃度(MIC)，以反映藥物對(duì)H.pylori的抑制作用。結(jié)果顯示二者均可以在體外抑制H.pylori的生長，其 MIC固體法為 1.25 g·L－1，液體法為 1.25 g·L－1。

2.3 中藥活性成分對(duì)H.pylori分泌的VacA活性的影響 本研究進(jìn)一步檢測(cè)了氫溴酸檳榔堿在體外對(duì)H.pylori分泌的VacA活性的影響。經(jīng)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)細(xì)胞無毒性作用的細(xì)胞濃度，且遠(yuǎn)低于相應(yīng)MIC藥物濃度的氫溴酸檳榔堿(0.15 g·L－1)干預(yù)處理的H.pylori培養(yǎng)上清，作用于BGC-823細(xì)胞，24 h后通過中性紅攝入法，檢測(cè)H.pylori分泌的VacA的細(xì)胞毒性，并以未經(jīng)藥物處理的H.pylori培養(yǎng)上清為VacA毒性對(duì)照組，和未加入VacA蛋白的細(xì)胞為細(xì)胞對(duì)照組。使用抑制率表示藥物對(duì)VacA活性的抑制能力。抑制率/%=［1－(處理組OD－細(xì)胞對(duì)照組OD)/(VacA毒性對(duì)照組OD－細(xì)胞對(duì)照組OD)］×100%。結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比較，未經(jīng)藥物處理的VacA蛋白對(duì)BGC-823細(xì)胞具有明顯的毒性作用(P＜0.01)，氫溴酸檳榔堿可明顯抑制VacA的活性，P＜0.01(Fig 2A)。其對(duì)VacA活性的抑制率達(dá)100%(Fig 2B)。

2.4 氫溴酸檳榔堿對(duì)VacA mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響 進(jìn)一步使用不抑制H.pylori生長的藥物濃度的氫溴酸檳榔堿(0.15 g· L－1)干預(yù)細(xì)菌24 h，收集細(xì)菌和培養(yǎng)上清，細(xì)菌菌體經(jīng)細(xì)胞裂解后，檢測(cè)細(xì)菌菌體中VacA mRNA和蛋白表達(dá)水平;并檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中VacA的蛋白水平，同時(shí)以藥物未干預(yù)細(xì)菌為對(duì)照。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，氫溴酸檳榔堿可明顯抑制菌體內(nèi)空泡毒素A mRNA(P＜0.05)和蛋白(P＜0.01)水平(Fig 3A)。且可明顯抑制H.pylori上清中VacA蛋白的表達(dá)(P＜0.01)(Fig 3B)。

3 討論

目前針對(duì)H.pylori治療雖已建立相當(dāng)有效的根治措施［12］。但下列問題仍使臨床醫(yī)生感到棘手:①正在逐漸上升的H.pylori耐藥性;②降低的根除率和升高的復(fù)發(fā)率;③患者對(duì)治療方法的依順性［13］。這些問題都提示我們需要從新的視角去審視H.pylori的致病機(jī)制及其治療策略。且有關(guān)H.pylori作為潛在正常微生物群的觀點(diǎn)也使醫(yī)學(xué)界需要更審慎的考慮這個(gè)問題。

受此提示，本研究選取了中藥檳榔、大腹皮的主要活性成分氫溴酸檳榔堿(AH)觀察其對(duì)VacA是否具有設(shè)想中的抑制作用。結(jié)果顯示在低于最低抑菌濃度(MIC)近十分之一濃度時(shí)，AH可以明顯抑制H.pylori分泌的VacA的細(xì)胞毒性作用，可以抑制VacA對(duì)細(xì)胞的空泡化毒性效應(yīng)。此結(jié)果與早期以中藥生藥水煎劑所進(jìn)行的同類研究結(jié)果吻合，證實(shí)檳榔、大腹皮中對(duì)VacA細(xì)胞毒性起抑制作用的藥理成分是AH。且經(jīng)換算，該劑量在臨床用藥的安全范圍之內(nèi)。而產(chǎn)生抑菌作用之濃度已大于該藥的安全范圍［14］。

Fig 2 Effects of AH on activities of VacA secreted by H.pylori in vitro

本研究繼續(xù)在VacA形成的mRNA及蛋白的表達(dá)和分泌水平上，分別對(duì)上述現(xiàn)象進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示，AH對(duì)菌體內(nèi)VacA mRNA及蛋白表達(dá)的抑制作用具有較好的一致性。且同時(shí)具有對(duì)VacA蛋白分泌的抑制作用。但其具體的抑制機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

Fig 3 Effects of AH on mRNA and protein level of VacA expressed in H.pylori or secreted by H.pylori

盡管AH已經(jīng)是一個(gè)臨床應(yīng)用久遠(yuǎn)的合成藥物，但其針對(duì)H.pylori毒素形成的抑制作用尚屬首次發(fā)現(xiàn)，考慮到AH自身的藥物副作用和抑制H.pylori毒素形成的時(shí)效問題尚需進(jìn)一步研究，故其臨床應(yīng)用尚有待時(shí)日。不過，不以殺菌為目的，而以抑制毒素形成為手段的應(yīng)對(duì)策略，對(duì)于H.pylori所引起之疾病以及類似的機(jī)會(huì)性感染都是一個(gè)值得考慮的探索方向，也是臨床新的藥理作用(尤其是中藥)發(fā)現(xiàn)與開發(fā)的一條蹊徑。

［1］Kuck D，Kolmerer B，Lking-Konert C，et al.Vacuolating cytotoxin of Helicobacter pylori induces apoptosis in the human gastric epithelial cell line AGS［J］.Infect Immun，2001，69(8):5080 －7.

［2］Kim S H，Park M，Woo H，et al.Inhibitory effects of anthocya-nins on secretion of Helicobacter pylori CagA and VacA toxins［J］.Int J Med Sci，2012，9(10):838 －42.

［3］Ashktorab H，Entezari O，Nouraie M，et al.Helicobacter pylori protection against Reflux esophagitis［J］.Dig Dis Sci，2012，57(11):2924－8.

［4］Blaser M J.An endangered species in the stomach［J］.Scientific American，2005，292(2):38－45.

［5］阮小明，李洪森，徐 琛.幽門螺桿菌黏附MKN45細(xì)胞模型的建立與應(yīng)用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(5):683 －6.

［5］Yuan X M，Li H S，Xu C.Development and application of antiadherent evaluation model of H pylori adherent to MKN45 cell［J］.Chin Pharmcol Bull，2010，26(5):683 －6.

［6］韓騰飛，高 昂，鞏 江，等.大腹皮藥學(xué)研究概況［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(14):8382 －4.

［6］Han T F，Gao A，Gong J，et al.An overview of pharmaceutical research on Pericarpium Arecae ［J］.J Anhui Agricultural Sci，2011，39(14):8382 －4.

［7］王恩湘，陳維順，余小梅，等.湘潭制檳榔與幽門螺桿菌感染關(guān)系研究［J］.世界華人消化雜志，2000，z1:70.

［7］Wang E X，Chen W S，Yu X M，et al.Research on the association between the processed Arecae and Helicobacter pylori［J］.World Chin J Digestol，2000，z1:70.

［8］梁昌盛，黃錦桃，王 玲，等.幽門螺桿菌體外培養(yǎng)條件的研究［J］.臨床醫(yī)學(xué)工程，2012，19(8):1259－60.

［8］Liang C S，Huang J T，Wang L，et al.Research on the conditions forin vitrocultivation of Helicobacter pylori［J］.Clin Med Engin，2012，19(8):1259－60.

［9］許華玉，林海祥.藥物抗菌作用測(cè)定方法［M］//馬緒榮，蘇德模，主編.藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè).北京:科學(xué)出版社，2001:210－3.

［9］Xu H Y，Lin H X.TestMethodsfor antibacterial effect of drugs［M］//Ma X R，Su D M.Inspection manual for medicine microbiology.Beijing:Science Press，2001:210 －3.

［10］杜奕奇，李兆申.幽門螺桿菌空泡毒素活性的體外觀察［J］.上海醫(yī)學(xué)，2005，28(10):858 －61.

［10］Du Y Q，Li Z S.Observations on vacuolating toxin of Helicobacter pyloriin vitro［J］.Shanghai Med J，2005，28(10):858 － 61.

［11］Wang F，Luo L D，Pan J H，et al.Comparative genomic study of gastric epithelial cells co-cultured with Helicobacter pylori［J］.World J Gastroenterol，2012，18(48):7212 －24.

［12］Sugizaki K，Sakata Y，Arai T，et al.A multicenter prospective observational study of triple therapy with Rabeprazole，Amoxicillin and Metronidazole for Helicobacter pylori in Japan［J］.Intern Med，2012，51(22):3103 －8.

［13］Seck A，Burucoa C，Dia D，et al.Primary antibiotic resistance and associated mechanisms in Helicobacter pylori isolates from Senegalese patients［J］.Ann Clin Microbiol Antimicrob，2013，12(1):3－7.

［14］Asthana S，Greig N H，Holloway H W，et al.Clinical pharmacokinetics of arecoline in subjects with Alzheimers disease［J］.Clin Pharmacol Ther，1996，60(3):276 －82.