川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1細(xì)胞的增殖和分化影響

陳小宇，祝愛珍，劉成成，朱錦燦，劉革修

(暨南大學(xué)血液病研究所，廣東廣州 510632)

川續(xù)斷屬于川續(xù)斷科川續(xù)斷屬，是一種多年生草本植物，主要生長于潮濕的山地。續(xù)斷是川續(xù)斷的干燥根提取物，在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)中有滋補(bǔ)、抗骨質(zhì)疏松、抗衰老等的功效，能夠治療腰背痛、外傷血腫、先兆流產(chǎn)和骨折等疾病［1］。Li等［2］研究表明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠通過激活PI3K/Akt通路抑制缺氧條件下心肌細(xì)胞的凋亡，Niu等［3］也通過研究證實(shí)了川續(xù)斷皂苷Ⅵ能夠激活p38和ERK1/2活性促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化，并且川續(xù)斷皂苷Ⅵ具有促進(jìn)大鼠體外間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)向成骨細(xì)胞增殖和分化的作用［4］。成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞由MSCs分化而來，MSC在適宜條件下還可以誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。機(jī)體內(nèi)成脂分化和成骨分化是相互制約、相互平衡的過程，目前實(shí)驗(yàn)已證實(shí)多種促進(jìn)成骨的藥物同時(shí)具有抑制成脂的作用，如維生素D3

［5］、利賽膦酸［6］、姜黃素［7］等，本研究就川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖和成脂分化影響進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 3T3-L1前脂肪細(xì)胞株由本研究所凍存，川續(xù)斷皂苷Ⅵ購于四川維克奇生物公司，DMEM高糖培養(yǎng)液、胰酶購自Hyclone公司，胎牛血清、地塞米松、IBMX、胰島素、油紅O染液購自GIBCO公司，噻唑藍(lán)購自科昊公司，葡萄糖及游離脂肪酸檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，RNAiso Reagent、cDNA合成試劑盒、RT-PCR試劑盒購自TOYOBO。

1.2 主要方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng) 3T3-L1前脂肪細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，每隔2 d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。

1.2.2 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 3T3-L1前脂肪細(xì)胞生長至完全融合后2 d開始誘導(dǎo)分化。即將DMEM完全培養(yǎng)液棄掉，換上含5 mg·L－1胰島素、0.5 mmol·L－1IBMX、1 μmol·L－1地塞米松的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，2 d后再換用含5 mg·L－1胰島素的 DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d。隨后用DMEM完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

1.2.3 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞以3×103/孔的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24h后換以含不同濃度(0、0.1、1、10、50、100 μmol·L－1)川續(xù)斷皂苷Ⅵ的培養(yǎng)液，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別在24、48和72 h檢測其增殖活性。加入20 μl 5 g·L－1MTT 工作液，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育，4 h后吸凈孔中液體，每孔加150 μl二甲基亞砜，震蕩10 min后在酶標(biāo)儀上讀取490 nm處的吸光度值。

1.2.4 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響 將3T3-L1前脂肪細(xì)胞接種至48孔板，待細(xì)胞完全融合2 d后開始誘導(dǎo)，分化過程中加入不同濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ(0、10、25、50 μmol·L－1)，觀察其對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂分化的影響。

1.2.5 油紅O染色 誘導(dǎo)分化6 d后細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定30 min后，用平衡鹽溶液(PBS)洗滌3次，加入油紅O染液孵育60 min，吸棄液體用PBS漂洗3次，倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況并攝像。加入異丙醇(每孔200 μl)，5 min后通過酶標(biāo)儀測量A520nm處的吸光度值。

1.2.6 葡萄糖及游離脂肪酸含量測定 收集各組誘導(dǎo)分化第6天培養(yǎng)液，參照試劑盒操作手冊(cè)說明，檢測各組葡萄糖及游離脂肪酸含量。

1.2.7 Q-PCR檢測成脂分化基因的表達(dá) 收集各組成脂誘導(dǎo)分化第6天細(xì)胞，用TRIzol試劑提取總RNA，分光光度計(jì)測定總 RNA濃度，A260/A280均在1.8～2.0之間。應(yīng)用隨機(jī)引物和反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用SYBR PremixEx TaqTM Real-time PCR試劑盒配制20 μl PCR反應(yīng)體系，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測成脂相關(guān)基因mRNA表達(dá)，熒光定量PCR引物見Tab 1。PCR擴(kuò)增條件為:93℃ 3 min，然后 93℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，共45個(gè)循環(huán)。以目的基因擴(kuò)增量/內(nèi)參照(GAPDH)基因擴(kuò)增量表示所要檢測基因的表達(dá)量。重復(fù)檢測3次，每次做3個(gè)復(fù)孔，分別計(jì)算同一樣品3個(gè)復(fù)孔的Ct值，以同一樣品中GAPDH Ct作為內(nèi)參照，分別計(jì)算各組2－ΔΔCt，用以±s表示PPARγ和C/EBP α mRNA相對(duì)表達(dá)量。

Tab 1 Primer sequences of the detected genes in Q-PCR analysis

2 結(jié)果

2.1 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖的影響 與空白組相比，川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理后對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞有促進(jìn)增殖效應(yīng)(P＜0.05)，結(jié)果如Tab 2。作用24 h后，從川續(xù)斷皂苷Ⅵ濃度為1 μmol·L－1開始，OD值隨藥物濃度增加而升高。隨著處理時(shí)間延長到72 h，只有100 μmol·L－1川續(xù)斷皂苷Ⅵ組OD值高于空白組，其余組促增殖效應(yīng)不明顯(P＞0.05)。

Tab 2 Effects of asperosaponinⅥon the proliferation of 3T3-L1 preadipocyte(±s，n=5)

Tab 2 Effects of asperosaponinⅥon the proliferation of 3T3-L1 preadipocyte(±s，n=5)

*P＜0.05 vs control

ASA/μmol·L －124 h 48 h 72 h 0 0.336 ±0.01 0.614 ±0.02 0.824 ±0.03 0.1 0.345 ±0.02 0.574 ±0.09 0.815 ±0.06 1 0.372 ±0.03* 0.634 ±0.06* 0.827 ±0.04 10 0.391 ±0.01* 0.665 ±0.03* 0.829 ±0.08 50 0.377 ±0.01* 0.665 ±0.05* 0.849 ±0.05 100 0.363 ±0.03* 0.601 ±0.04 0.896 ±0.04*

2.2 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響 于誘導(dǎo)分化過程中加入不同濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ(0、10、25、50 μmol·L－1)處理 6 d，采用油紅 O染色，顯微鏡下觀察并攝像，如Fig 1所示，川續(xù)斷皂苷Ⅵ抑制成脂，隨著藥物濃度增加3T3-L1細(xì)胞中被染色的脂滴含量明顯下降。用異丙醇萃取油紅O后，不同濃度組OD值與對(duì)照組比較均明顯下降(P＜0.05)，見 Fig 2。

Fig 1 Oil red O staining after adipogenic induction of differentiation for 6 days

Fig 2 Effects of asperosaponinⅥon lipid accumulation after adipogenic induction of differentiation for 6 days

2.3 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞糖脂代謝的影響 誘導(dǎo)分化后第6天每組上清液中的葡萄糖及游離脂肪酸的濃度，結(jié)果顯示加入25、50 μmol·L－1川續(xù)斷皂苷Ⅵ組培養(yǎng)上清中葡萄糖高于對(duì)照(P＜0.05)，10 μmol·L－1川續(xù)斷皂苷Ⅵ抑制葡萄糖效應(yīng)作用不明顯(P＞0.05);而各組游離脂肪酸濃度則均低于對(duì)照組(P＜0.05)，且呈劑量依賴性，見Fig 3。

Fig 3 Effects of asperosaponinⅥon the concentration of glucose(up)and non-esterified fatty acid(down)in culture supernatant after adipogenic induction of differentiation for 6 days

2.4 川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響 3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化過程中，加入 10、25、50 μmol·L－1濃度組的川續(xù)斷皂苷Ⅵ處理6 d后均能明顯抑制PPARγ和C/EBP α mRNA表達(dá)(P＜0.05)，如Fig 4。各組PPARγ mRNA抑制率分別為 68.8%、42.2%、34.7%;C/EBP α mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比亦下降，各組分別為80.0%、32.3%、6.3%。為了研究川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞成脂作用的時(shí)間點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)在成脂的不同時(shí)間(d 0～6，d 1～2，d 3 ～4，d 5 ～6)加入川續(xù)斷皂苷Ⅵ(50 μmol·L－1)，發(fā)現(xiàn)川續(xù)斷皂苷Ⅵ在成脂不同時(shí)間點(diǎn)加入均有抑制作用，成脂分化d 3-4加入川續(xù)斷皂苷Ⅵ抑制效應(yīng)最明顯(PPARγ和C/EBP α mRNA抑制率分別為19.6%、26.4%，P＜0.05)，見 Fig 5。

3 討論

Fig 4 Effects of asperosaponinⅥat different concentrations on the transcriptional level of PPAR γ and C/EBP α mRNA after adipogenic induction of differentiation for 6 days

Fig 5 Effects of ASA VI(50 μmol·L －1)at various intervals on the transcriptional level of PPAR γ and C/EBP α mRNA after adipogenic induction of differentiation for 6 days

機(jī)體脂肪細(xì)胞分化過程包括定向分化和終末分化兩個(gè)階段［8］。由MSC向前體脂肪細(xì)胞分化的過程屬于定向分化，終末分化則是指前脂肪細(xì)胞形成成熟脂肪細(xì)胞的過程。前體脂肪細(xì)胞雖然具有成脂分化能力，但如果沒有外源性的成脂刺激，不會(huì)自發(fā)的進(jìn)入終末分化階段。研究顯示多種轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞周期蛋白參與了調(diào)節(jié)成熟脂肪細(xì)胞形成［9］，其中過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)、CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白(CCAAT/enhancer-binding proteins，C/EBPs)是終末分化過程中不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子［10］。PPARs是一類能被過氧化物酶體增殖物激活的核內(nèi)受體家族，包括 PPARα、PPARβ 和 PPARγ，其中 PPARγ 與脂肪細(xì)胞分化最為密切。PPARγ與配體結(jié)合后被激活，與視黃酸X受體形成PPARγ-RXR異二聚體，進(jìn)一步同反應(yīng)元件結(jié)合激活靶基因最終導(dǎo)致終末分化的脂肪細(xì)胞形成［11］。C/EBP家族與脂肪細(xì)胞分化相關(guān)的 3個(gè)成員為:C/EBPα、C/EBPβ和 C/EBPδ。細(xì)胞接受成脂刺激后 C/EBPβ和 C/EBPδ的表達(dá)增加，促進(jìn)成脂分化。在成脂分化后期C/EBPβ和C/EBPδ降低。C/EBPα可結(jié)合和激活特異性基因的啟動(dòng)子，促進(jìn)脂肪細(xì)胞進(jìn)入終末分化階段［12］。本研究探討了川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞的增殖、成熟分化的影響及其機(jī)制。結(jié)果不僅發(fā)現(xiàn)，在處理 24 ～72 h 期間，1 ～100 μmol·L－1濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ均顯示有促進(jìn)3T3-L1前脂肪細(xì)胞增殖作用，其中10 μmol·L－1濃度組作用24 h后細(xì)胞增殖最明顯，隨著川續(xù)斷皂苷Ⅵ濃度增加，促增殖效應(yīng)不明顯;在處理72 h時(shí)，只有100 μmol·L－1川續(xù)斷皂苷Ⅵ組細(xì)胞增殖明顯高于空白組，其余組促增殖效應(yīng)不明顯。該結(jié)果說明川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)3T3-L1前脂肪細(xì)胞有一定的促其增殖作用。這也可能提示存在川續(xù)斷皂苷Ⅵ在培養(yǎng)基中不穩(wěn)定或者被細(xì)胞代謝等因素。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。同時(shí)更主要發(fā)現(xiàn)有，10、25、50 μmol·L－1濃度川續(xù)斷皂苷Ⅵ能劑量依賴性抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化，降低脂肪細(xì)胞中脂滴聚集，減少成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液中葡萄糖的吸收利用，并減少培養(yǎng)液中游離脂肪酸的形成。Q-PCR檢測結(jié)果則顯示川續(xù)斷皂苷Ⅵ能下調(diào)成脂過程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PPARγ和C/EBPα基因表達(dá)，也呈劑量依賴性。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)當(dāng)在成脂分化的不同時(shí)間點(diǎn)加入50 μmol·L－1川續(xù)斷皂苷Ⅵ均能下調(diào) PPARγ 和 C/EBPαmRNA表達(dá)，說明川續(xù)斷皂苷Ⅵ能作用成脂終末分化的整個(gè)環(huán)節(jié)，抑制脂肪細(xì)胞形成。但川續(xù)斷皂苷Ⅵ是否也能抑制成脂定向分化以及怎樣調(diào)節(jié)PPARγ和C/EBPα表達(dá)的信號(hào)機(jī)制還有待研究。

機(jī)體MSC是成脂分化和成骨分化的共同前體細(xì)胞，具有雙向性，但是相互制約。骨髓中MSC是造血干細(xì)胞微環(huán)境重要組成部分，也具有成骨和成脂雙向分化特性，向成骨細(xì)胞分化則對(duì)造血具有促進(jìn)作用［13］，而向脂肪細(xì)胞分化則對(duì)造血具有負(fù)性作用［14］。在傳統(tǒng)中醫(yī)中川續(xù)斷皂苷Ⅵ已經(jīng)顯示具有治療骨質(zhì)疏松的作用，即促進(jìn)成骨作用，但在抑制成脂分化方面的研究較少。本研究結(jié)果則不僅可進(jìn)一步了解其藥理作用，同時(shí)可為研究臨床上骨髓脂肪化提供新的思路。

［1］Hung T M，Jin W，Thuong P T，et al.Cytotoxic saponins from the root of Dipsacus asper Wall［J］.Arch Pharm Res，2005，28(9):1053－6.

［2］Li C，Tian J，Li G，et al.AsperosaponinⅥ protects cardiac myocytes from hypoxia-induced apoptosis viaactivation of the PI3K/Akt and CREB pathways［J］.Eur J Pharmacol，2010，649(1 － 3):100－7.

［3］Niu Y，Li Y，Huang H，et al.AsperosaponinⅥ，a saponin component from Dipsacus asper wall，induces osteoblast differentiation through bone morphogenetic protein-2/p38 andextracellular signalregulated kinase 1/2 pathway［J］.Phytother Res，2011，25(11):1700－6.

［4］武密山，趙素芝，任立中，等.川續(xù)斷皂苷Ⅵ誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化的研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(2):222 －6.

［4］Wu M S，Zhao S Z，Ren L Z，et al.Experimental study of akebia saponin D on the differentiation of rat bone marrow derived mesenchymal stem cells to osteoblastsin vitrovia induction［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(2):222 －6.

［5］Duque G，Macoritto M，Kremer R.1，25(OH)2D3inhibits bone marrow adipogenesis in senescence accelerated mice(SAM-P/6)by decreasing the expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2(PPARgamma2)［J］.Exp Gerontol，2004，39(3):333－8.

［6］Jin J，Wang L，Wang X K，et al.Risedronate inhibits bone marrow mesenchymal stem cell adipogenesis and switches RANKL/OPG ratio to impair osteoclast differentiation［J］.J Surg Res，2013，180(1):e21 －9.

［7］Zhao J，Sun X B，Ye F，et al.Suppression of fatty acid synthase，differentiation and lipid accumulation in adipocytes by curcumin［J］.Mol Cell Biochem，2011，351(1－2):19－28.

［8］Otto T C，Lane M D.Adipose development:from stem cell to adipocyte［J］.Crit Rev Biochem Mol Biol，2005，40(4):229 －42.

［9］Gregoire F M，Smas C M，Sul H S.Understanding adipocyte differentiation［J］.Physiol Rev，1998，78(3):783 －809.

［10］Cristancho A G，Lazar M A.Forming functional fat:a growing understanding of adipocyte differentiation［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2011，12(11):722 －34.

［11］Kawai M，Rosen C J.PPARγ:a circadian transcription factor in adipogenesis and Osteogenesis［J］.Nat Rev Endocrinol，2010，6(11):629－36.

［12］Yeh W C，Cao Z，Classon M，et al.Cascade regulation of terminal adipocyte differentiation by three members of the C/EBP family of leucine zipper Proteins［J］.Genes Dev，1995，9(2):168 －81.

［13］Calvi L M，Adams G B，Weibrecht K W，et al.Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche［J］.Nature，2003，425(6960):841－6.

［14］Naveiras O，Nardi V，Wenzel P L，et al.Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment［J］.Nature，2009，460(7252):259 －63.