梓醇促進局灶腦缺血大鼠皮質(zhì)脊髓束芽生和重塑

萬 東，祝慧鳳，呂發(fā)金，羅 勇，謝 鵬

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.急診科＆重癥醫(yī)學(xué)科、3.放射科、4.神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400016;2.西南大學(xué)藥學(xué)院暨中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400716)

腦卒中急性期后，神經(jīng)修復(fù)時間窗開啟，伴隨著腦內(nèi)血管新生、神經(jīng)新生、軸突芽生和突觸重構(gòu)等神經(jīng)可塑性事件的發(fā)生發(fā)展，受損的病灶周圍區(qū)神經(jīng)環(huán)路、皮質(zhì)間神經(jīng)環(huán)路以及皮質(zhì)與皮質(zhì)下神經(jīng)環(huán)路逐步修復(fù)，神經(jīng)缺失功能得以恢復(fù)［1］。但成體大腦神經(jīng)可塑性明顯抑制，內(nèi)源性自發(fā)性神經(jīng)修復(fù)能力非常有限。尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突生長限制性微環(huán)境的存在更不利于皮質(zhì)脊髓束(corticospinal tract，CST)等長距離軸突再生/芽生，成為受累肢體功能殘障的重要原因［2］。因此，采用藥物或細(xì)胞治療手段激發(fā)、維持或放大卒中后神經(jīng)修復(fù)機制可望使眾多的腦卒中患者獲益。但目前尚未發(fā)現(xiàn)確切有效的促神經(jīng)修復(fù)藥物。

梓醇是地黃主要的有效單體成分，其神經(jīng)保護作用及促神經(jīng)修復(fù)效應(yīng)近年受到廣泛關(guān)注。本課題組及國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，梓醇可誘導(dǎo)離體培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元［3］及 PC12細(xì)胞［4］軸突生長，上調(diào)缺血性腦卒中大鼠腦內(nèi)軸突再生分子標(biāo)志物——生長相關(guān)蛋白43(growth-associated protein-43，GAP-43)蛋白表達［5］，增加缺血周圍區(qū)大腦皮質(zhì)神經(jīng)氈內(nèi)突觸數(shù)目［6］，促進缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)-血管單元修復(fù)［7］，明顯改善模型大鼠神經(jīng)功能結(jié)局。課題組近期觀察到［8］，梓醇可下調(diào)腦缺血后健側(cè)感覺運動大腦皮質(zhì)髓鞘相關(guān)蛋白Nogo-A及其受體NgR蛋白表達，但梓醇能否促進CST等長距離軸突芽生和重塑目前尚未探討。因此，本研究觀察梓醇對局灶腦缺血大鼠皮質(zhì)脊髓束軸突芽生和重塑的影響，以期揭示梓醇促卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)的神經(jīng)解剖學(xué)機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 30只鼠齡相同的成年健康Sprague-Dawley大鼠，♀♂不拘，體質(zhì)量(220～250)g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(合格證號:檢動字2002A040)。隨機數(shù)字法將動物分為假手術(shù)組、模型組、生理鹽水組、梓醇治療組和胞磷膽堿對照組，每組6只。

1.2 藥品與器材 梓醇購自中國藥品生物制品檢定所(產(chǎn)品批號:110808-200508，規(guī)格:20 mg/支)，胞磷膽堿鈉注射液為山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品(國藥準(zhǔn)字H14021994，規(guī)格:125 g·L-1)。BDA-10000為美國Molecular Probes公司產(chǎn)品(產(chǎn)品號:D1956，產(chǎn)品編號:13-9139，規(guī)格:25 mg/支)。兔抗 GAP-43多克隆抗體、Cy3標(biāo)記羊抗兔 IgG、FITC標(biāo)記鏈霉親和素、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記鏈霉親和素以及DAB顯色試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司。CM1850型冰凍切片機及TSCPS2型激光共聚焦顯微鏡均為德國Leica公司產(chǎn)品，Olympus BS-50型生物顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.3 模型制備 參照文獻［5，7］，采用腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，顳側(cè)低位開顱法電凝右側(cè)大腦中動脈位于嗅束與大腦下靜脈之間的一段，制備局灶永久性腦缺血模型。假手術(shù)組除不凝閉右側(cè)大腦中動脈外，其余步驟和模型組相同。術(shù)中保持直腸溫度在(37.0±0.5)℃。

1.4 模型成功的判斷與納入標(biāo)準(zhǔn) 術(shù)后24 h，采用Bederson評分評估受累肢體神經(jīng)缺失功能狀況:0分，無神經(jīng)功能缺失癥狀;1分，左前肢屈曲，但不伴其他異常，即提尾懸空實驗陽性;2分，提尾懸空實驗陽性，同時側(cè)推抵抗力下降(即側(cè)向推力實驗陽性)，但自由活動時無轉(zhuǎn)圈行為;3分，同2分行為，且自由活動時向癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈。評分為1～3分的大鼠納入實驗。

1.5 藥物干預(yù) 依據(jù)課題組前期研究結(jié)果［9］，確定梓醇和胞磷膽堿給藥劑量分別為5 mg·kg-1和0.5 g·kg-1，均用生理鹽水配制，每次給藥總體積為3 ml。生理鹽水組腹腔注射等體積生理鹽水。假手術(shù)組和模型組不給任何藥物干預(yù)。藥物干預(yù)組均于術(shù)后24h首次經(jīng)腹腔注射給藥，每日1次，連續(xù)7 d。

1.6 神經(jīng)行為學(xué)測試

1.6.1 黏貼片移除實驗 參照文獻［10］，造模前、pMCAO 術(shù)后1 d(給藥前)、4、7、14、21 及28 d，在受累前肢腕部背側(cè)黏貼6 cm×0.5 cm的膠帶，然后將大鼠放回鼠籠，密切觀察和記錄大鼠感知并移除膠帶所耗費的總時間，以評價受累前肢感覺運動功能狀況。各時點測試兩次，每次測試最長計時為120 s，兩次測試的間隔時間大于10 min。

1.6.2 足失誤實驗 參照文獻［11］，制備長75 cm、寬45 cm、高70 cm的網(wǎng)格平臺，網(wǎng)格大小為2.5 cm×2.5 cm，網(wǎng)格線(鐵絲)直徑1.5 mm。將大鼠放在平臺上自由活動時，若出現(xiàn)受累前肢(本實驗為左前肢)踏空而掉入網(wǎng)眼中，記為足失誤1次。記錄2 min內(nèi)左前肢失誤次數(shù)和行走的總步數(shù)，計算左前肢失誤次數(shù)占總步數(shù)的百分比，以評估大鼠受累前肢運動的準(zhǔn)確性。

1.7 磁共振成像檢測腦梗死體積 pMCAO術(shù)后1 d(給藥前)和28 d時，采用TOSHIBA VISART 1.5T超導(dǎo)核磁共振成像儀，選用膝正交線圈(QD)，行頭顱T2WI掃描。測量各組大鼠腦梗死絕對體積占對側(cè)大腦半球體積的百分比，即相對腦梗死體積。

1.8 BDA順行神經(jīng)示蹤 參照文獻［12］，pMCAO術(shù)后15 d，大鼠麻醉后固定于江彎Ⅰ型腦立體定位儀上。常規(guī)消毒后縱向切開頭皮、顱骨骨膜，暴露前囟。以前囟為原點，標(biāo)記如下4點，定位大鼠左前肢感覺運動皮質(zhì)區(qū)，即前囟向嘴側(cè)4.0 mm，再分別向左側(cè)旁開1 mm和5 mm;前囟向尾側(cè)1.0 mm，再分別向左側(cè)旁開1 mm和5 mm。用骨鉆去除上述區(qū)域的骨瓣，制備大小約5 mm×4 mm的骨窗。用4.5號注射針頭刺破硬腦膜，暴露左側(cè)感覺運動皮質(zhì)區(qū)，用 10μl微量進樣器將 10% 生物素化 BDA-10000溶液(用0.01 mol·L-1磷酸鹽生理鹽水緩沖液配置，pH 7.3)分層多點注射于左側(cè)感覺運動皮質(zhì)區(qū)(深度1.0～1.5 mm)，每例注射5點，每點注射1 μl，總量 5 μl。5 個注射點的坐標(biāo)定位如下:① A=-1.0 mm，L=+1.0 mm;② A=-1.0 mm，L=+5.0 mm;③ A=+4.0 mm，L=+1.0 mm;④ A=+4.0 mm，L=+5.0 mm;⑤ 為①③連線與②④連線的交點;其中，A示以前囟為中心向前，L示以前囟為中心向左側(cè)方。每點注射完畢，將進樣器針頭停留在針道內(nèi)5 min，以免藥液外溢。

注射示蹤劑后3 h(此時大鼠麻醉已清醒)，將大鼠提尾懸空，可見右上肢屈曲抱胸，癥狀持續(xù)3～5 h后自然消失。以此作為示蹤劑準(zhǔn)確注入左側(cè)大腦皮質(zhì)運動區(qū)的成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.9 實驗取材 注射示蹤劑2周后(即pMCAO術(shù)后28 d)，深麻醉大鼠，用4%多聚甲醛溶液灌流固定。冰上剝離脊髓標(biāo)本，采集脊髓頸膨大(C4～C6))。用Leica-cm 1850型冰凍切片機冠狀位連續(xù)切片，脊髓片厚50 μm。收集所有脊髓片，進行BDA標(biāo)記纖維顯色或免疫熒光雙標(biāo)組織化學(xué)染色。

1.10 BDA標(biāo)記纖維顯色 脊髓片放人含0.3%Triton X-100 的 0.05 mol·L-1Tris-HCl(TBS，pH 7.6)中，4℃孵育過夜。用0.05 mol·L-1TBS中漂洗切片3次，每次5 min;切片轉(zhuǎn)入辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液中(1∶200稀釋)，4℃孵育過夜;0.05 mol·L-1TBS漂洗切片4次，每次5 min;鎳劑預(yù)染10 min，0.05 mol·L-1TBS漂洗切片2次，每次10 min;將切片轉(zhuǎn)至二氨基聯(lián)苯胺(DAB)工作液(含 0.05%DAB、0.04% 硫酸鎳、0.03%H2O2和0.05 mol·L-1TBS)中內(nèi)呈色反應(yīng)10～20 min。用0.1 mol·L-1TBS終止反應(yīng)。切片裱于APES包被的載片上，晾干后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片，光鏡下觀察并采集圖像。

1.11 漂浮法免疫熒光雙標(biāo)記 采用自由漂浮法行免疫熒光雙標(biāo)記組織化學(xué)染色。用FITC標(biāo)記的親和素檢測BDA標(biāo)記的纖維，用Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG二抗匹配兔抗GAP-43多克隆抗體(一抗)檢測組織中GAP-43蛋白表達。主要步驟:脊髓片用含有0.3%Triton X-100 的0.02 mol·L-1PBS(PBST)漂洗3次后，正常山羊血清工作液室溫封閉30 min;轉(zhuǎn)移至GAP-43一抗工作液(1∶300)中，4℃孵育過夜(14～16 h);0.02 mol·L-1PBST漂洗脊髓片3次后，轉(zhuǎn)移至FITC標(biāo)記的親和素(1∶100)和Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶200)混合工作液中，37℃避光孵育2 h;0.02 mol·L-1PBST漂洗脊髓片4次后，裱片，50%緩沖甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察BDA/GAP-43共定位并采集圖像。用0.02 mol·L-1PBS代替一抗、熒光抗體工作液作為陰性對照，其余步驟同上。

1.12 半定量分析

1.12.1 計量CST越邊纖維 參考文獻［13］，采用NIH Image J圖像分析軟件，以脊髓中央管和脊髓前正中裂連線為脊髓左右半側(cè)的分界標(biāo)志，計量失神經(jīng)支配側(cè)脊髓腹側(cè)運動角BDA陽性標(biāo)記纖維(越邊纖維)數(shù)目占脊髓健側(cè)腹側(cè)運動角BDA陽性標(biāo)記軸突數(shù)目的百分比，以校正不同動物感覺運動皮質(zhì)神經(jīng)元對示蹤劑敏感性的差異。每只動物取5張脊髓切片，200×光鏡下觀察并采集圖像。計算5張脊髓片CST越邊纖維百分比的平均值，用實驗組6只大鼠越邊纖維百分比的平均值進行統(tǒng)計分析。

1.12.2 免疫熒光雙標(biāo)圖像采集與半定量分析 參考文獻［14］，脊髓片置于激光共聚焦顯微鏡下觀察，測量紅色熒光強度系數(shù)以反映GAP-43表達強弱;并用系統(tǒng)自帶軟件進行圖像疊加處理，獲得BDA/GAP-43共定位信號(呈黃色)，采用NIH ImageJ圖像分析軟件，分析每組圖像的皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson相關(guān)系數(shù))，以間接反映共定位像素值大小。每只動物觀察3張切片，每組6只，取各指標(biāo)的平均值進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

30只大鼠均成功造模并進行BDA標(biāo)記。

2.1 各組受累前肢感覺運動功能恢復(fù)狀況 黏貼片移除實驗結(jié)果顯示，術(shù)前、術(shù)后1和4 d各組黏貼片移除時間差異無顯著性(P＞0.05)，術(shù)后7、14、21和28 d，梓醇組和胞磷膽堿組黏貼片移除時間均比模型組和生理鹽水組對應(yīng)時點明顯縮短(P＜0.05);其中，術(shù)后28 d，梓醇組較胞磷膽堿組黏貼片移除時間明顯縮短(P＜0.05);各組間足失誤實驗結(jié)果也存在上述差異。提示梓醇和胞磷膽堿均可促進受累前肢感覺運動功能恢復(fù)，但梓醇作用優(yōu)于胞磷膽堿;見Fig 1。

Fig 1 Treatment with catalpol improves performances in the behavioral tests

2.2 各實驗組腦梗死體積 pMCAO致腦梗死范圍包括右側(cè)大腦半球感覺運動皮質(zhì)、紋狀體和部分丘腦。pMCAO術(shù)后1 d(給藥前)及術(shù)后28 d各組腦梗死體積差異無顯著性(P＞0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Lesion volume among groups at 1 and 28 day after pMCAO

2.3 梓醇增強脊髓頸膨大區(qū)CST纖維重塑 BDA神經(jīng)示蹤顯示，大鼠CST在脊髓頸膨大節(jié)段集中走行在脊髓后(背)索。生理狀態(tài)下，CST絕大部分纖維投射至同側(cè)脊髓前角;腦缺血后，健側(cè)CST發(fā)出分支越邊支配對側(cè)脊髓前角。半定量分析顯示，模型組越邊纖維占4.7% ±1.3%，較假手術(shù)組(1.4%±0.5%)明顯增加(P＜0.05);梓醇組越邊纖維占8.5%±2.1%，較模型組、生理鹽水組(5.2% ±0.8%)和胞磷膽堿組(5.5% ±1.8%)明顯增加(P＜0.05)。表明梓醇可增強腦缺血后CST軸突重塑，見 Fig 2。

A:sham operation group;B:pMCAO model only;C:catalpol group;D:citicoline group;Broken lines in A to D indicate the midline of spinal cord;Asterisks indicate the left denervated spinal gray matter

2.4 梓醇促進脊髓頸膨大區(qū)CST纖維芽生 激光共聚焦顯微鏡下觀察，綠色熒光顯示BDA標(biāo)記的健側(cè)CST，紅色熒光顯示GAP-43表達陽性的新生軸突纖維，紅色熒光強度系數(shù)越大，則GAP-43表達水平越高;BDA/GAP-43共定位呈黃色，顯示健側(cè)CST新生的芽生軸突。BDA/GAP-43共定位分析，Pearson相關(guān)系數(shù)越大則脊髓頸膨大區(qū)健側(cè)CST新生的芽生軸突纖維越多。結(jié)果顯示模型組紅色熒光強度系數(shù)為0.76±0.17，較假手術(shù)組(0.46±0.37)明顯增強(P＜0.05);梓醇組為1.80±0.25，明顯強于其他各實驗組(P＜0.05);提示缺血性腦卒中可刺激CST軸突自發(fā)性芽生，而梓醇對CST軸突芽生有明顯促進作用。進一步分析各組Pearson相關(guān)系數(shù)，結(jié)果模型組(0.17±0.06)大于假手術(shù)組(0.11±0.08)，組間差異具有顯著性(P＜0.05);梓醇組(0.60±0.15)較模型組、生理鹽水組(0.19±0.03)和胞磷膽堿組(0.26±0.06)均明顯增加(P＜0.05);提示梓醇可明顯促進局灶腦缺血后健側(cè)CST軸突芽生，見Fig 3。

3 討論

腦卒中后受累肢體功能恢復(fù)的神經(jīng)解剖學(xué)機制目前尚無完全明了，但與病灶部位、損傷程度以及卒中病程等因素密切相關(guān)。一側(cè)感覺運動皮質(zhì)或錐體束嚴(yán)重受損時，通常需要對側(cè)大腦半球的參與，以實現(xiàn)受損神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)和功能重組［15］。因此，病灶對側(cè)大腦半球在卒中后神經(jīng)修復(fù)中的作用日益受到重視。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血后2周，受累肢體感覺運動功能已明顯恢復(fù)。此時病灶對側(cè)感覺運動皮質(zhì)受到傷害性刺激(如本研究中定點注射神經(jīng)示蹤劑)，可使左前肢再度出現(xiàn)癱瘓體征，進一步證實病灶對側(cè)感覺運動皮質(zhì)的神經(jīng)環(huán)路重構(gòu)參與了腦缺血受累肢體功能恢復(fù)。

皮質(zhì)脊髓束(CST)起源于大腦皮質(zhì)錐體神經(jīng)元，直接或間接與脊髓運動神經(jīng)元聯(lián)接，是控制隨意運動精確性的主要神經(jīng)通路。一側(cè)大腦半球缺血性卒中后，病灶對側(cè)大腦半球感覺運動皮質(zhì)與雙側(cè)的紋狀體、丘腦、腦橋以及脊髓等皮層下運動相關(guān)區(qū)域重建纖維聯(lián)系有助于受累肢體功能恢復(fù)。已有研究證實，成體動物腦卒中后，源于病灶對側(cè)大腦半球的CST在脊髓水平的越邊纖維數(shù)量與神經(jīng)缺失功能恢復(fù)狀況呈正相關(guān)［16］。但成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)CST等長距離軸突在腦缺血后芽生或再生非常困難，病灶對側(cè)感覺運動皮質(zhì)與皮層下運動相關(guān)區(qū)域建立雙側(cè)支配的能力較弱，成為腦卒中患者功能恢復(fù)不佳甚至殘留永久性神經(jīng)功能缺失的主要原因。因此，CST是腦缺血損傷后中樞神經(jīng)再生研究關(guān)注的焦點。本研究采用受累前肢黏貼物移除實驗和足失誤實驗證實缺血性腦卒中后24 h延遲給予梓醇干預(yù)仍能有效促進受累前肢感覺運動功能恢復(fù)。進一步采用微量注射法，在病灶對側(cè)大腦皮質(zhì)感覺運動區(qū)多點注射生物素葡聚糖胺(BDA)，順行追蹤CST，了解梓醇對CST纖維芽生和重塑的影響。結(jié)果觀察到，正常情況下，大鼠CST絕大部分纖維支配同側(cè)脊髓前角，很少繞過脊髓中央管前后越邊支配對側(cè)脊髓前角。但腦缺血后，病灶對側(cè)CST纖維芽生并越邊支配對側(cè)脊髓失神經(jīng)支配區(qū)的數(shù)量明顯增加，同時伴隨腦缺血受累前肢感覺運動功能恢復(fù)，提示病灶對側(cè)CST纖維芽生在腦缺血后功能恢復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。梓醇干預(yù)后，病灶對側(cè)CST越邊纖維數(shù)量比模型組和胞磷膽堿組明顯增加，并伴隨受累前肢感覺運動功能明顯優(yōu)于對照組，提示梓醇對腦缺血后神經(jīng)元長距離軸突重塑有促進作用，有利于受累肢體功能恢復(fù)。

Fig 3 Treatment with catalpol after pMCAO promotes CST axonal sprouting and remodeling shown in BDA/GAP-43 immunofluorescence double staining at the cervical enlargement level

鑒于腦卒中后幸存大腦皮質(zhì)與靶神經(jīng)元間重建神經(jīng)聯(lián)接主要依賴如下3種神經(jīng)修復(fù)機制:①啟用功能未激活的既存神經(jīng)環(huán)路;②冗余神經(jīng)環(huán)路的功能替代;③ 幸存神經(jīng)纖維芽生和突觸新生。因此，本研究在證實梓醇可促進CST軸突重塑的基礎(chǔ)上，進一步采用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測BDA標(biāo)記纖維與GAP-43共定位，以期明確梓醇能否增強或維持CST軸突芽生能力。結(jié)果腦缺血后4周，梓醇治療組CST芽生軸突仍大量表達GAP-43，BDA/GAP-43共定位信號明顯強于模型組和胞磷膽堿組(P＜0.05)。GAP-43是一種神經(jīng)組織特有的糖蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和損傷再生等事件中常能監(jiān)測到GAP-43在mRNA和蛋白水平表達上調(diào)，對神經(jīng)元生長、發(fā)育和軸突再生起明顯促進作用。國際上將GAP-43作為神經(jīng)生長發(fā)育和損傷修復(fù)等神經(jīng)可塑性研究的首選分子探針，是神經(jīng)元軸突再生的分子標(biāo)志，反映軸突再生能力的強弱。上述研究結(jié)果表明，梓醇對CST軸突芽生有促進和維持作用。這可能是梓醇組功能恢復(fù)狀況優(yōu)于其他實驗組的重要原因。

在成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，軸突生長狀態(tài)(尤其是長距離軸突再生)受生長促進因子和生長抑制因子共同調(diào)節(jié)［17］。勿動蛋白(Nogo-A)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘相關(guān)糖蛋白(OMgp)等髓鞘相關(guān)蛋白以及硫酸軟骨素(CSPG)和tenascin等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白所構(gòu)成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突生長限制性微環(huán)境不利于皮質(zhì)脊髓束(CST)等長距離軸突再生/芽生，成為受累肢體功能殘障的重要原因［2］。Nogo-A/NgR信號軸激活可引起軸突生長錐崩解，致使軸突再生失敗。梓醇可下調(diào)缺血性腦卒中后大腦皮質(zhì)髓鞘相關(guān)蛋白Nogo-A及其受體NgR蛋白表達，改善軸突生長微環(huán)境［8］，這可能是梓醇明顯促進CST軸突芽生和重構(gòu)的重要神經(jīng)生化學(xué)分子基礎(chǔ)。

綜上，本研究從形態(tài)學(xué)角度證實了梓醇可促進腦卒中后CST芽生和重塑，但梓醇促神經(jīng)修復(fù)的藥理作用靶點及分子作用機制尚待進一步探討。深入研究這些問題，可望為腦卒中后神經(jīng)修復(fù)治療提供極具臨床轉(zhuǎn)化潛能的藥物干預(yù)手段。

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