糙米發(fā)芽過(guò)程中蛋白酶活力動(dòng)態(tài)變化研究

魯紅俠，杜先鋒，陳文幫，許亮亮

（1.合肥師范學(xué)院生命科學(xué)系，安徽合肥230601；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥230601；3.安徽省獸藥飼料監(jiān)查所，安徽合肥230601）

糙米發(fā)芽過(guò)程可顯著提高蛋白酶[1]、淀粉酶[2]、谷氨酸脫羧酶[3]等內(nèi)源酶活力及還原糖、游離氨基酸[4]等營(yíng)養(yǎng)成分含量，并有效降低抗?fàn)I養(yǎng)因子植酸[5]的含量。發(fā)芽期間，糙米內(nèi)的蛋白酶和谷氨酸脫羧酶等被激活，積累大量的γ-氨基丁酸（GABA）。GABA具有降低血壓增強(qiáng)腦細(xì)胞代謝，活化腎功能、改善肝功能、防止肥胖、降壓、促進(jìn)乙醇代謝和消除體臭等多種醫(yī)療保健功能[6-8]。發(fā)芽糙米中GABA含量大幅度升高的主要途徑之一是蛋白酶水解蛋白質(zhì)生成一定量的谷氨酸，谷氨酸由谷氨酸脫羧酶催化生成GABA[9]。曹曉虹[1]，丁俊胄等[2]對(duì)糙米在不同發(fā)芽時(shí)間的蛋白酶活力進(jìn)行了研究，然而每種酶都有其最適溫度，在不同溫度下，達(dá)到酶活高峰期的時(shí)間也不一樣。但是針對(duì)采用不同溫度、時(shí)間浸泡和發(fā)芽的糙米，其發(fā)芽過(guò)程中蛋白酶活力的動(dòng)態(tài)變化研究卻未見(jiàn)報(bào)道。硒是一種與人及其他哺乳動(dòng)物生理密切相關(guān)的微量元素，兼具營(yíng)養(yǎng)、毒性、解毒三重生物學(xué)功能，被稱為“生命保護(hù)劑”。在糙米發(fā)芽過(guò)程中添加亞硒酸鈉溶液，使糙米在發(fā)芽過(guò)程中富集GABA同時(shí)進(jìn)行富硒，將有毒性的無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為具有生理活性的有機(jī)硒。本研究根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，利用響應(yīng)曲面法（RSM）對(duì)糙米發(fā)芽過(guò)程中蛋白酶活力影響因素的條件進(jìn)行優(yōu)化，分析浸泡時(shí)間、發(fā)芽時(shí)間、發(fā)芽溫度、亞硒酸鈉濃度對(duì)蛋白酶活力動(dòng)態(tài)變化的影響，建立影響蛋白酶活力因素的數(shù)學(xué)模型。為更進(jìn)一步研究富硒發(fā)芽糙米中蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物谷氨酸及谷氨酸在谷氨脫羧酶作用下生成GABA的機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，并為開(kāi)發(fā)新型富硒發(fā)芽糙米食品提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糙米（遼粳294） 安徽燕之坊食品有限公司提供；GABA 純度99%標(biāo)準(zhǔn)樣品，購(gòu)自Sigma公司；硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 100μg/mL；乙腈、甲醇 色譜純；亞硒酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、無(wú)水乙醇、三氯乙酸（TCA） 均為分析純，由上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1260型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；RV10BS25型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 美國(guó)IKA公司；SPX-150C型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Multifuge X1R型高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；UV-1800型紫外分光光度計(jì)、RF-5301PC型原子熒光光度計(jì) 日本島津公司；電子天平 上海精密科學(xué)儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糙米發(fā)芽工藝流程

糙米→除雜→篩選→分級(jí)→清洗→瀝干→浸泡→發(fā)芽→干燥→除根→發(fā)芽糙米。

1.2.1.1 原料準(zhǔn)備 選取大小均勻一的糙米粒，用自來(lái)水洗去糙米表面灰塵，再用蒸餾水清洗，瀝干。

1.2.1.2 浸泡 在36℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中浸泡。

1.2.1.3 發(fā)芽 將不同條件下吸水脹潤(rùn)的糙米放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行不同時(shí)間、不同溫度催芽（相對(duì)濕度為90%）。糙米的芽長(zhǎng)為1mm左右時(shí)是發(fā)芽糙米的最佳狀態(tài)[10]，本實(shí)驗(yàn)的糙米材料發(fā)芽24h即可達(dá)到芽長(zhǎng)1mm左右，當(dāng)芽長(zhǎng)超過(guò)2mm時(shí)，發(fā)芽糙米色澤偏黃、易發(fā)霉，并產(chǎn)生發(fā)酵味，嚴(yán)重影響產(chǎn)品品質(zhì)。

1.2.2 蛋白酶液提取及酶活測(cè)定 在Harvey等[11]的測(cè)定方法上稍有修改。稱取2.00g發(fā)芽糙米，用16mL磷酸緩沖液（pH7.2），冰浴研磨勻漿，4℃下10000r·min-1離心30min，上清液為蛋白酶粗提液。1mL底物（20g·L-1酪蛋白溶液）與1mL粗酶液在40℃下保溫10min，90℃水浴5min滅酶，再加入2mL 0.14mol·L-1TCA溶液，室溫下放置15min沉淀殘余的蛋白質(zhì)，6000r·min-1離心15min后上清液在275nm處測(cè)定吸光值。以酪氨酸作標(biāo)準(zhǔn)，先加TCA溶液為對(duì)照。將1g發(fā)芽糙米粗酶液催化酪蛋白每分鐘產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為1個(gè)蛋白酶活力單位（U）。以反應(yīng)前先加入TCA溶液的體系為對(duì)照。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 選擇對(duì)酶活力有影響的四個(gè)因素，即發(fā)芽時(shí)間（X1）、浸泡時(shí)間（X2）、發(fā)芽溫度（X3）和亞硒酸鈉濃度（X4），按照1.2.2方法提取蛋白酶液，3次重復(fù)，并測(cè)定酶活。

1.2.3.1 浸泡時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響 取糙米樣品150g，放入35℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中浸泡，每隔3h，分別取出20g糙米樣品，置于35℃培養(yǎng)箱中，發(fā)芽24h取樣提取蛋白酶液并測(cè)定酶活。

1.2.3.2 發(fā)芽時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響 取糙米樣品150g，放入35℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中浸泡6h，分別取出20g糙米樣品，置于35℃培養(yǎng)箱中，發(fā)芽12h后，每隔12h取樣提取蛋白酶液并測(cè)定酶活。

1.2.3.3 發(fā)芽溫度對(duì)蛋白酶活力的影響 取糙米樣品150g，放入35℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中浸泡6h，分別取出20g糙米樣品，置于不同培養(yǎng)箱中，設(shè)置不同的發(fā)芽溫度（20、25、30、35、40、45℃），發(fā)芽24h取樣提取蛋白酶液并測(cè)定酶活。

1.2.3.4 亞硒酸鈉濃度對(duì)蛋白酶活力的影響 取糙米樣品，設(shè)置不同濃度亞硒酸鈉浸泡液（0、5、10、20、30、40mg/L）浸泡6h，分別取糙米樣品，置于35℃培養(yǎng)箱中，發(fā)芽24h取樣提取蛋白酶液并測(cè)定酶活。

1.2.4 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn) 結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，采用四因子三水平的響應(yīng)曲面分析方法，分別用X1、X2、X3和X4來(lái)表示，并以+1、0、-1分別代表變量的水平，按照方程xi=（Xi-X0）/△X對(duì)自變量進(jìn)行編碼，式中，xi為變量的編碼值，Xi為變量的真實(shí)值，X0為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)變量的真實(shí)值，△X為變量的變化步長(zhǎng)，蛋白酶活力為響應(yīng)值（表1）。

表1 中心組合設(shè)計(jì)Box-Benhnken方案設(shè)計(jì)的因素和水平編碼值表Table 1 Independent variables and levels for central composite rotatable design

1.2.5 發(fā)芽糙米中GABA提取與測(cè)定 準(zhǔn)確稱取優(yōu)化條件下發(fā)芽的3.0g糙米，置于研缽中加超純水手工研磨成勻漿狀，定容到25mL，再于恒溫水浴振蕩器上振蕩提取1h，用0.45μm濾膜過(guò)濾，即為樣品提取液，采用HPLC法[12]測(cè)定GABA含量。HPLC分析條件為：色譜柱：安捷倫Zorbax Eclipse-AAA，C184.6mm×150mm，5μm；流動(dòng)相：由A、B雙組分組成，A，VCH3CN∶VH2O=1∶1；B，pH7.0的磷酸鹽緩沖液。流速為1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm；柱溫35℃；進(jìn)樣量10μL。

1.2.6 發(fā)芽糙米中有機(jī)硒含量的測(cè)定 糙米按照優(yōu)化后的浸泡和培養(yǎng)條件進(jìn)行發(fā)芽，待發(fā)芽結(jié)束后，將發(fā)芽糙米用大量蒸餾水充分清洗，以去除表面殘留的亞硒酸鈉，55℃烘干至恒重后，采用原子熒光光度法[13]測(cè)定硒含量。有機(jī)硒含量=總硒-無(wú)機(jī)硒。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸泡時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響 從圖1可以看出，隨著浸泡糙米時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活是先升高再降低，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)浸泡時(shí)間超過(guò)12h，浸泡液開(kāi)始變渾濁，并產(chǎn)生異味，這是由于浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成糙米表層發(fā)生部分溶解，微生物大量滋生。表明浸泡糙米的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，短時(shí)間浸泡可以很快達(dá)到酶活高峰期，但浸泡超過(guò)一定時(shí)間反而對(duì)酶活有一定的抑制作用，最適宜的浸泡時(shí)間為6h，酶活達(dá)到最高值。

圖1 浸泡時(shí)間對(duì)酶活力的影響Fig.1 Effects of soaking time on enzyme activity

2.1.2 發(fā)芽溫度對(duì)蛋白酶活力的影響 從圖2可以看出，45℃時(shí)，發(fā)芽糙米的酶活達(dá)到最高值，但實(shí)際情況是此溫度下的發(fā)芽糙米剛剛露白，由于溫度超過(guò)糙米發(fā)芽的適宜溫度，發(fā)芽的糙米開(kāi)始干癟，不能繼續(xù)發(fā)芽，嚴(yán)重影響發(fā)芽糙米品質(zhì)，此數(shù)值不宜采用。當(dāng)發(fā)芽溫度低于45℃時(shí)，蛋白酶活先升高而后降低，當(dāng)溫度達(dá)到35℃時(shí)，酶活最高，說(shuō)明在糙米的適宜發(fā)芽溫度范圍內(nèi)，低溫條件下，對(duì)蛋白酶有激活作用，而超過(guò)35℃，溫度的升高開(kāi)始抑制酶活力。

圖2 發(fā)芽溫度對(duì)酶活力的影響Fig.2 Effects of germination temperature on enzyme activity

2.1.3 發(fā)芽時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響 從圖3可以看出，糙米發(fā)芽時(shí)間在24h內(nèi)，蛋白酶活力迅速提高，當(dāng)發(fā)芽時(shí)間超過(guò)36h，酶活隨著發(fā)芽時(shí)間增加而降低，這可能是由于發(fā)芽時(shí)間過(guò)長(zhǎng)后，在發(fā)芽過(guò)程中產(chǎn)生的可溶性固形物溶于水中而流失掉，且微生物大量繁殖，開(kāi)始出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象。最適宜發(fā)芽時(shí)間在24～36h，達(dá)到發(fā)芽糙米的最佳狀態(tài)1mm左右，酶活力達(dá)到最高值。

圖3 發(fā)芽時(shí)間對(duì)酶活力的影響Fig.3 Effects of germination time on enzyme activity

2.1.4 亞硒酸鈉濃度對(duì)蛋白酶活力的影響 從圖4可以看出，低濃度亞硒酸鈉對(duì)蛋白酶有激活作用，而高濃度亞硒酸鈉對(duì)酶活有抑制作用，當(dāng)亞硒酸鈉濃度20mg/L時(shí)，酶活力最高。

圖4 亞硒酸鈉濃度對(duì)酶活力的影響Fig.4 Effects of the concentration of sodium selenite on enzyme activity

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

利用Design Expert 8.0軟件，對(duì)表2的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到蛋白酶活力對(duì)發(fā)芽時(shí)間（X1）、浸泡時(shí)間（X2）、發(fā)芽溫度（X3）和亞硒酸鈉濃度（X4）的二次多項(xiàng)回歸模型為：Y=3.66+0.82X1+0.59X2-0.88X3-0.27X4-0.59X2X4+0.51X3X4-0.57X42，對(duì)該模型進(jìn)行方程分析及顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design matrix and results

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 ANOVA analysis and coefficients significant test for regression equation

由表3可以看出，模型回歸系數(shù)是3.66，p＜0.0001，R2=91.55%，表明回歸模型極顯著，該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合很好；失擬項(xiàng)p=0.064＞0.05，不顯著；調(diào)整后的R2為83.10%，即表明模型可以解釋83.10%的蛋白酶活力的變化，進(jìn)一步說(shuō)明回歸方程的擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可信度高，該模型是合適的，可以用此模型對(duì)蛋白酶活力動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的影響因素進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)；各因素中X1、X2、X3、X4、X2X4、X3X4、X42效應(yīng)均顯著，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。由響應(yīng)面回歸分析和回歸方程擬合可以繪出響應(yīng)面圖形，見(jiàn)圖5、圖6。

由圖5可知，當(dāng)亞硒酸鈉處于低濃度時(shí)，酶活力隨著浸泡時(shí)間的增加而增加，且增加幅度較大；當(dāng)亞硒酸鈉處于高濃度時(shí)，酶活力隨著浸泡時(shí)間的增加其增加幅度而減小。糙米進(jìn)行短時(shí)間浸泡時(shí)，隨著亞硒酸鈉濃度增大，蛋白酶活力先升高后降低；當(dāng)進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間浸泡時(shí)，酶活力隨著亞硒酸鈉濃度增大呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，且亞硒酸鈉濃度越大，下降的趨勢(shì)越顯著。因?yàn)椴诿壮浞治浭遣诿装l(fā)芽的必要條件，當(dāng)糙米充分吸脹飽和、浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)就會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p害，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量損耗。細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞必然會(huì)使蛋白酶的活性受到抑制，從而也會(huì)影響到酶解產(chǎn)物GABA的生成。因此，浸泡時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。

圖6 亞硒酸鈉濃度（X4）與發(fā)芽溫度（X3）響應(yīng)面立體分析圖Fig.6 Response surface plot of concentration of Sodium seleniteand germination emperature

由圖6可知，在發(fā)芽溫度不變的條件下，當(dāng)亞硒酸鈉濃度逐漸增大時(shí)，發(fā)芽糙米的蛋白酶活力是先升高后降低的趨勢(shì)，亞硒酸鈉濃度大于20mg/L時(shí)，加入的亞硒酸鈉對(duì)蛋白酶活起到抑制作用。不同濃度亞硒酸鈉溶液浸泡的糙米，在發(fā)芽溫度不斷升高的情況下，蛋白酶活力呈下降趨勢(shì)，隨著亞硒酸鈉濃度的增大，酶活力下降的趨勢(shì)變緩。因?yàn)槿魏畏N子發(fā)芽和酶的激活都有自己的最適溫度，溫度偏低、偏高都會(huì)使呼吸速率降低，為糙米種子發(fā)芽提供的能量減少，物質(zhì)轉(zhuǎn)化的速度變慢，進(jìn)而影響蛋白酶活及酶解產(chǎn)物GABA的生成。

2.3 最佳工藝參數(shù)的確定

為求得影響蛋白酶活力動(dòng)態(tài)變化規(guī)律因素的最佳參數(shù)，利用回歸擬合方程分別對(duì)各自的變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，并令其為0可得到曲面的穩(wěn)定點(diǎn)，即最大值點(diǎn)。蛋白酶活力最大估計(jì)值為5.11U，各因素的取值分別為發(fā)芽時(shí)間24h、浸泡時(shí)間9h、發(fā)芽溫度30℃和亞硒酸鈉濃度20mg/L。為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，在此條件下對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，得到蛋白酶活力為5.09U，與理論預(yù)測(cè)值5.11U接近。由此可以看出，利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化富硒發(fā)芽糙米蛋白酶提取工藝是可行的、有效的。

2.4 發(fā)芽糙米中GABA的含量

GABA標(biāo)準(zhǔn)色譜圖及發(fā)芽糙米色譜圖分別見(jiàn)圖7、圖8。

圖7 GABA標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.7 Chromatogram of γ-aminobutyric acid standard powder sample

圖8 發(fā)芽糙米色譜圖Fig.8 Chromatogram of the germinated brown rice

在此優(yōu)化發(fā)芽條件下，測(cè)得的GABA含量為144.33mg/100g。

2.5 發(fā)芽糙米中有機(jī)硒含量

采用原子熒光光度法測(cè)得優(yōu)化條件下發(fā)芽的糙米中有機(jī)硒含量為0.376mg/kg。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示糙米在富硒發(fā)芽過(guò)程中將有毒性的無(wú)機(jī)硒生物轉(zhuǎn)化為有生理活性、易于人體吸收的有機(jī)硒。同時(shí)糙米發(fā)芽過(guò)程中，內(nèi)源酶系統(tǒng)被激活，糙米的食用營(yíng)養(yǎng)價(jià)值大幅度提升。在不同溫度下發(fā)芽的糙米，低濃度的亞硒酸鈉對(duì)酶活力有一定的激活作用，而高濃度的亞硒酸鈉對(duì)酶活有抑制作用，其蛋白酶活力動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)總體是先升高再降低。每種酶都有其最適溫度，過(guò)高過(guò)低對(duì)酶活都有一定的抑制作用，研究結(jié)果表明溫度35℃時(shí)，糙米發(fā)芽24h，酶活達(dá)到最大有效值。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用中心組合設(shè)計(jì)對(duì)糙米發(fā)芽過(guò)程中蛋白酶活力的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律影響因素進(jìn)行了優(yōu)化。最佳條件工藝參數(shù)為發(fā)芽時(shí)間24h、浸泡時(shí)間9h、發(fā)芽溫度30℃和亞硒酸鈉濃度20mg/L，在此條件下，蛋白酶活力為5.09U，GABA含量為144.33mg/100g，是未發(fā)芽糙米的28倍，有機(jī)硒含量為0.376mg/kg。

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