超聲輔助提取兗州卷柏生物堿及其對H22肝癌細(xì)胞增殖抑制影響

邱丹纓，溫?fù)P敏，謝永華，蘇 齊，余瓊瓊，林文東

（1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，福建泉州362011；2.福建省泉州市醫(yī)藥研究所，福建泉州362000）

兗州卷柏（Selaginella involvens，Spring）為卷柏科植物兗州卷柏的全草，是多年生草本植物[1]。兗州卷柏具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、降血糖、增強人體免疫功能等作用[2-3]。生物堿是最古老的藥物之一，也是現(xiàn)今藥物的最主要來源之一。近年來，國內(nèi)外對各種生物堿的研究利用愈來愈深入。本文研究超聲波輔助乙醇法對兗州卷柏生物堿提取，設(shè)計正交實驗優(yōu)選出超聲波提取兗州卷柏生物堿的最佳條件，為兗州卷柏的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

兗州卷柏 采自福建寧化縣治平鄉(xiāng)泥坑村，由泉州市醫(yī)藥研究所蘇齊主任醫(yī)師鑒定；鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品 購自上海源葉生物科技有限公司；小鼠H22肝癌細(xì)胞株 購自天呈科技生物公司；DMSO，MTT，RPMI1640培養(yǎng)基，小牛血清 購自賽默飛世爾科技公司（北京）；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒購自碧云天生物公司；注射用環(huán)磷酰胺（CTX） 購自山西普德藥業(yè)有限公司（國藥準(zhǔn)字H14023686）；氯仿 AR，天津市化學(xué)試劑一廠；無水乙醇 西隴化工股份公司；溴甲酚綠指示劑 稱取0.02g溴甲酚綠溶于1.43mL的0.02mol/L的NaOH溶液，雙蒸水稀釋至50mL；乙酸乙酸納緩沖液（pH=4.0） 稱取8.2g無水乙酸鈉，加23mL冰醋酸并稀釋至250mL。

SP-752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；VGT-1620QTD型超聲波清洗機 深圳市興宏業(yè)投資有限公司；RE5210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海予騰生物科技有限公司；KHBST-360型酶標(biāo)儀 上?？迫A；HF-90型CO2培養(yǎng)箱 北京陽光思特生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物堿提取工藝研究

1.2.1.1 不同乙醇濃度對兗州卷柏生物堿提取的影響 取兗州卷柏全草除雜，水洗后曬干。放入粉碎機粉碎3min成粉末。稱取5g兗州卷柏粉末，放入500mL錐形瓶，再加入60%、70%、80%、90%和100%乙醇150mL于室溫浸泡24h。用功率30W，頻率34Hz超聲波處理40min后過濾，取上清液烘箱烘干。將烘干后的粉末，加入2%HCl溶液100mL浸泡12h后過濾，用氨水溶液調(diào)至pH=10。取上清液用于測定生物堿含量。另外，取分液漏斗依次加入上清液和氯仿萃取，反復(fù)萃取至無生物堿反應(yīng)為止，減壓蒸餾，回收氯仿得到生物堿粉末[4]。

1.2.1.2 不同固液比對兗州卷柏生物堿提取的影響稱取5g兗州卷柏粉末，放入500mL錐形瓶，再加入固液比（g/mL）為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的70%乙醇于室溫浸泡24h。在功率30W，頻率34Hz超聲波處理40min后過濾，取上清液烘箱烘干。將烘干后的粉末，加入2%HCl溶液100mL浸泡12h后過濾，用氨水溶液調(diào)至pH=10。取上清液5mL用于測定生物堿含量。

1.2.1.3 正交實驗對兗州卷柏生物堿提取的影響 在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上設(shè)計三因素三水平正交實驗，因素水平見表1。生物堿提取方法同1.2.1.1。

表1 提取生物堿的實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of alkaloid extraction

1.2.2 生物堿含量測定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 精確配制濃度為0.40、0.20、0.10、0.05、0.025mg/mL的鹽酸小蘗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取不同濃度的鹽酸小蘗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL置于分液漏斗中，接著加入2.5mL乙酸鈉緩沖液，再加入2.0mL溴甲酚綠指示液，振蕩5min，靜置分層20min。另外，取1mL雙蒸水，用同樣方法制備空白對照組。取氯仿層，以空白對照組調(diào)零，在415nm處測定吸光度[5]。以鹽酸小蘗堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=4.865x+0.140（R2=0.996）。

1.2.2.2 樣品生物堿含量測定 取兗州卷柏提取液1mL，置于分液漏斗中，接著加入2.5mL乙酸鈉緩沖液，再加入2.0mL溴甲酚綠指示液，振蕩5min，靜置分層20min。另外，取1mL雙蒸水，用同樣方法制備空白對照組。取氯仿層，以空白對照組調(diào)零，在415nm處測定吸光度。按標(biāo)準(zhǔn)曲線計算生物堿含量。

生物堿提取率（%）=生物堿質(zhì)量/兗州卷柏粉末質(zhì)量×100 式（1）

1.2.3 生物堿對肝癌細(xì)胞H22增殖抑制作用 采用MTT法[6]測定生物堿對H22肝細(xì)胞增殖抑制作用。H22肝癌細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在5%CO2、37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，分于96孔板，調(diào)整細(xì)胞濃度約6000個細(xì)胞每孔。每孔分別加入含生物堿0（空白對照組）、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/mL的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，另設(shè)一組含2mg/mL環(huán)磷酰胺（CTX）作為陽性對照。細(xì)胞分別培養(yǎng)12、24、48h。按MTT試劑盒說明書測定細(xì)胞抑制率。

抑制率（%）=（1-實驗組吸光度/空白對照度吸光度）×100 式（2）

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對兗州卷柏生物堿提取的影響

不同乙醇濃度對兗州卷柏生物堿提取的影響見圖1。從圖1可以看出，乙醇濃度小于70%時，生物堿提取率隨乙醇濃度增加而增多。而乙醇濃度大于70%以上，生物堿提取率隨乙醇濃度增加而減少。當(dāng)乙醇濃度為70%時，兗州卷柏生物堿提取率最多，達1.08%。

圖1 乙醇濃度對生物堿提取率的影響Fig.1 Effect of different concentration of ethanol on extracting rate of alkaloids

2.2 固液比對兗州卷柏生物堿提取的影響

固液比對兗州卷柏生物堿提取的影響見圖2。從圖2可以看出，當(dāng)固液比小于1∶40g/mL時，隨著固液比增加兗州卷柏生物堿提取率迅速增高。但當(dāng)固液比大于1∶40g/mL時，繼續(xù)增加乙醇量，兗州卷柏生物堿提取率趨于穩(wěn)定。其原因可能是增加乙醇量有利于生物堿的溶解。但當(dāng)加乙醇量達到一定程度時，生物堿已全部溶解，所以繼續(xù)增加乙醇量生物堿提取率不再增加?？紤]到固液比大，會給后續(xù)工序帶來困難，消耗較多熱能等，綜合各方面考慮，適宜的固液比為1∶40g/mL。

圖2 固液比對生物堿提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extracting rate of alkaloid

2.3 正交實驗優(yōu)化生物堿提取工藝

表2 生物堿提取的正交實驗Table 2 Orthogonal experiment of extracting alkaloid

表3 物堿提取的正交實驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment of extracting alkaloid

通過預(yù)實驗選擇設(shè)計三因素三水平正交實驗，研究超聲波對生物堿提取的最佳條件。其結(jié)果見表2。從表2可以看出影響生物堿提取的首要因素是超聲功率，其次是超聲時間和超聲溫度（B＞A＞C）。根據(jù)方差分析（見表3），超聲功率和時間對生物堿提取影響顯著（p＜0.05），而超聲溫度對生物堿提取有一定影響，但影響不顯著（0.05＜p＜0.10）。生物堿提取最佳工藝是超聲時間60min、超聲功率400W、超聲溫度60℃（A3B2C2）。驗證實驗表明，此時提取率達1.18%。

2.4 生物堿對H22肝癌細(xì)胞增殖抑制作用

兗州卷柏生物堿對H22肝癌細(xì)胞體外增殖抑制作用見圖3，從圖3可以看出細(xì)胞培養(yǎng)12h后，實驗組對H22肝癌細(xì)胞的抑制率均低于對照組（CTX組），但所有實驗組與對照組之間均無顯著差異（p＞0.05）。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，SIA4和SIA5對肝癌細(xì)胞抑制率高于對照組，且SIA5與對照組之間存在顯著差異（p＜0.05）。細(xì)胞培養(yǎng)48h后，SIA3、SIA4和SIA5對肝癌細(xì)胞抑制率高于對照組，其中SIA4和SIA5與對照組之間存在顯著差異（p＜0.05）。其中SIA5生物堿濃度為8mg/mL時，對肝癌細(xì)胞增殖抑制率達53.25%。

圖3 生物堿對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.3 Effect of alkaloid on growth inhibition of hepatocellular carcinoma cell

3 討論

3.1 超聲波輔助兗州卷柏生物堿提取工藝影響

生物堿有效成分的高效提取是中草藥開發(fā)的關(guān)鍵與難點，新技術(shù)的研究與開發(fā)能大大提高中草藥中生物堿的回收率與質(zhì)量，并節(jié)約大量的時間和能源。超聲波作為一種特殊的能量形式，作為一種新技術(shù)在中草藥有效成分的提取、藥物制劑工藝的改進、藥物的合成與降解、以及在生物藥劑中的運用等方面倍受青睞[7]。陳志慧等[8]用索氏回流、常規(guī)浸提、超聲波3種方法提取斷腸草總堿，結(jié)果表明，超聲波提取方法生物堿提取效率最高。金艷梅等[9]研究表明，75%乙醇對蒲公英生物堿提取效率最高。李俶等[10]研究表明，乙醇濃度為100%對槲寄生有效成分中生物堿的提取效率最高，而最佳的固液比是1∶30。本研究表明，對兗州卷柏生物堿提取率最高乙醇濃度為70%，而固液比為1∶40，其原因可能是，不同生物體所含生物堿種類有所差異，而不同生物堿在不同濃度乙醇中的溶解度不同。

3.2 兗州卷柏生物堿對肝癌細(xì)胞增殖抑制作用

兗州卷柏作為治療肝炎的中藥應(yīng)用已有悠久歷史，《福建民間草藥》記載：兗州卷柏具有清肝熱，療黃疸功效。林美珍等[11]使用兗州卷柏治療20例肝炎患者，得到顯著療效。在廣東仁化縣等地，民間使用兗州卷柏熬水內(nèi)服兩個療程（每一療程為7d）后，可以得到較顯著的療效[12]。張昊[2]研究充州卷柏的四種黃酮類化合物與抗肝癌藥物甲氨蝶吟（MTX）和人肝癌細(xì)胞HepG2的體外增殖抑制作用，結(jié)果表明，4種兗州卷柏黃酮類化合物對體外人肝癌細(xì)胞HePG2均有一定的抑制活性。其中化合物6-羥基-2-對羥基苯基-苯并毗喃酮-8-乙酸、4’-甲氧基羅伯斯特雙黃酮、羅伯斯特雙黃酮、穗花杉雙黃酮的抑制活性與MTX相近，而化合物羅伯斯特雙黃酮在不同濃度的抑制率和IC50值，都顯示出比陽性對照MTX具有更強的抑制活性。本實驗結(jié)果與以上實驗相似，兗州卷柏生物堿對小鼠肝癌H22細(xì)胞有顯著生長抑制效果。表明兗州卷柏含有抑制肝癌細(xì)胞的有效活性成分，其活性成分的鑒定及抗肝癌機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

超聲輔助法是兗州卷柏生物堿提取的有效方法。最佳工藝為：乙醇濃度70%、固液比1∶40、超聲時間60min、超聲功率400W和超聲溫度60℃。影響生物堿提取的首要因素是超聲功率，其次是超聲處理時間和超聲溫度。不同濃度兗州卷柏生物堿對小鼠H22肝癌細(xì)胞均有抑制效果，其中生物堿濃度為8mg/mL時，培養(yǎng)48h對肝癌細(xì)胞增殖抑制率達53.25%。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院編．《中藥大辭典》[M]．上冊.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，l446-l447．

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