烷化劑EMS誘導(dǎo)劍麻愈傷組織突變方法研究

張燕梅，李俊峰，周文釗

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所/海南省熱帶作物營養(yǎng)重點實驗室(籌)，廣東 湛江524091)

劍麻為龍舌蘭科龍舌蘭屬植物，主要分布在美洲、非洲、大洋洲等熱帶亞熱帶高溫干旱的半荒漠地帶［1］，其中墨西哥資源最豐富，被認(rèn)為是龍舌蘭麻的起源地［2］。我國龍舌蘭科植物有7個屬共41個種［3］，主要分布在廣東、廣西、福建、海南和云南等地［4］。近幾十年，劍麻育種工作者不斷從國外引進一些新的種質(zhì)資源，也先后開展了劍麻雜交育種工作，并且獲得了一些優(yōu)良種質(zhì)［3，5］，但劍麻種質(zhì)資源嚴(yán)重缺乏的現(xiàn)象仍然存在。劍麻H.11648是由Lock等［6］從假菠蘿麻與藍劍麻雜交再與藍劍麻回交后的雜交后代中篩選出來的，該品種具有葉片纖維含量高，年產(chǎn)葉片多，葉緣無刺且抗寒等特點，自1963年首次從坦喀尼喀引入我國［3］，經(jīng)大面積試種成功后，目前已成為我國唯一當(dāng)家品種，種植面積達98%以上［4］。由于該品種抗真菌能力較差［6］，病蟲害不斷滋生，嚴(yán)重影響了劍麻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)［7］，因此，開展劍麻遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新尤為重要。

EMS為一種常用的化學(xué)誘變劑，自首次報道可有效誘導(dǎo)突變以來，已廣泛應(yīng)用于作物誘變育種。該方法操作簡單方便，科學(xué)工作者們常利用EMS誘變處理，結(jié)合其它的方法，定向的篩選抗旱［8］、耐鹽［9，10］、抗?。?1，12］等新種質(zhì)，已取得良好的進展。但有關(guān)劍麻EMS誘變等方面的研究還未見報道。本研究以劍麻愈傷組織為材料，開展劍麻EMS誘變研究，為劍麻種質(zhì)資源創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

劍麻(Agave hybrid cv No.11648)來源于本實驗室保存的無菌試管苗?；瘜W(xué)誘變劑EMS(甲基磺酸乙酯)購自Sigma公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

以劍麻無菌苗莖尖為材料，縱切后接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上先進行暗培養(yǎng)1－2各個月，待愈傷組織誘導(dǎo)出后再置于半光條件下培養(yǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6－BA 2.0 mg/l+NAA 0.2 mg/l+蔗糖 30 g/l+卡拉膠 7.5 g/l。培養(yǎng)條件為:溫度26±2℃，光照12 h/d，光強1500 lux。每4周繼代1次。

1.2.2 EMS 誘變處理

0.1 mol/l的磷酸緩沖液的配制和使用方法參照文獻［13］，經(jīng)高壓滅菌后保存?zhèn)溆?。以磷酸緩沖液為溶劑，分別配制濃度為0.2%、0.4%、0.6%、0.8% 和1.0%的 EMS處理液，并以不加EMS的磷酸緩沖液為對照，分別處理2 h，4 h，6 h，8 h和16 h。取黃豆大小的淡黃綠色的塊狀或團狀的愈傷組織于以上濃度的EMS處理液中進行EMS誘變處理，處理完后用無菌水漂洗3－5次，用濾紙吸干后接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周，然后再轉(zhuǎn)入不定芽分化培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。不定芽分化培養(yǎng)基為SH+6－BA 3.0 mg/l+NAA 0.2 mg/l+IBA 0.3 mg/l+蔗糖30 g/l+卡拉膠7.5 g/l，培養(yǎng)條件同上。

1.3 數(shù)據(jù)分析與處理

每個組合處理20塊愈傷組織團塊，處理3次，培養(yǎng)1個月后觀察愈傷組織生長以及植株再生情況，并用SAS統(tǒng)計軟件進行分析處理(不包括污染的)。致死率=死亡的愈傷組織塊數(shù)/處理的愈傷組織總數(shù)×100%，不定芽分化率=(分化出不定芽的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù))×100%，分化系數(shù)=(所有分化出的不定芽總數(shù)/分化不定芽的愈傷組織數(shù))×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS對劍麻愈傷組織生長的影響

EMS對劍麻愈傷組織生長的影響如表1所示:不同EMS濃度，相同處理時間內(nèi)，隨著EMS濃度的升高，愈傷組織生長受到明顯抑制，愈傷組織死亡率增加。用0.2%和0.4%的EMS處理2 h時，愈傷組織生長良好，與對照無明顯差異，當(dāng)EMS濃度增加到0.8%時，愈傷組織死亡率為15.0%，EMS濃度為1.0%時，愈傷死亡率為30.8%。用0.6% －1.0%的EMS處理16 h，愈傷組織在1周內(nèi)全部死亡。相同濃度，隨著處理時間的延長，愈傷組織生長受到抑制，死亡率增加。在所試濃度范圍內(nèi)，處理4 h和6 h的愈傷組織生長與處理2 h的愈傷組織生長無明顯差異，處理8 h則發(fā)生明顯變化，愈傷組織生長受抑制，愈傷組織死亡率增加，用大于0.6%的EMS處理16 h時，除對照外，愈傷組織全部死亡。由此推斷，低濃度短時間的EMS處理可促進愈傷組織的生長。高濃度或長時間處理抑制愈傷組織生長。用0.2%的EMS處理愈傷組織致死率比用0.4%和0.6%的EMS處理的致死率要高，可能與外植體的大小有關(guān)，在用0.2%的EMS進行處理時，有1/4的外植體的大小進行減半。這些較小的愈傷組織團塊經(jīng)EMS處理后多數(shù)死亡。用0.8%和1.0%的EMS分別處理6 h和4 h，愈傷致死率分別為52.22±1.11%和56.67±1.67%，超過“半致死”劑量，可以用作篩選劍麻EMS突變體的濃度組合(圖1)。

表1 不同處理濃度和時間對劍麻愈傷組織生長的影響Tab.1 Effect of 30 treatments with six concentration levels and five time points on sisal callus growth

圖1 愈傷組織在0.2%EMS處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h和16 h后的生長情況A，B，C，D，E，F(xiàn) 分別為處理 0.2%EMS 0 h，2 h，4 h，6 h，8 h 和 16 hFig.1 Callus growth treated with 0.2%EMS for 0 h，2 h，4 h，6 h，8 h and 16 h respectively

2.2 EMS對劍麻不定芽發(fā)生的影響

如表2所示:對照處理的愈傷組織分化率均在95%以上，分化系數(shù)在28.83±2.72與24.00±5.56之間，即表明磷酸緩沖液對植株再生無影響。用0.2%的EMS處理2－4 h，分化系數(shù)均在27.00±5.56以上，與對照無明顯差異，隨著處理時間的延長，分化系數(shù)明顯下降，處理16 h時分化系數(shù)僅有15.37 ±1.86，顯著低于對照水平 24.00 ±5.56。用 0.4%、0.6%、0.8% 和 1.0% 的EMS進行處理，也獲得相同的結(jié)果。相同處理時間，隨著EMS濃度的增加，分化系數(shù)也明顯下降。并且分析發(fā)現(xiàn)，分化系數(shù)與愈傷組織生長呈現(xiàn)正相關(guān)性，在相同處理組合內(nèi)，愈傷組織生長越大越快，分化系數(shù)越高，可能與愈傷組織的活力有關(guān)。低濃度EMS有利于愈傷組織生長和分化系數(shù)升高，隨著EMS濃度升高和處理時間延長，再生植株分化受到抑制。用0.8%和1.0%的EMS分別處理6 h和4 h，愈傷組織致死率超過“半致死”劑量，分化率分別為46.8%和41.7%，分化系數(shù)分別為7.63 ±1.10 和7.13 ±2.79(如圖2)。

表2 不同處理時間和濃度對劍麻植株再生的影響Tab.1 Effect of 30 treatments with six concentration levels and five time points on sisal plant regeneration

圖2 用0.8%和1.0%的EMS分別處理6 h和4 h獲得的不定芽。左為0.8%處理6 h，右為1.0%處理4 hFig.2 Adventitious buds obtained from sisal callus treated with 0.8%and 1.0%EMS for 6 h and 4 h respectively

3 結(jié)論與討論

3.1 低濃度的EMS有利于愈傷組織的生長

突變體是開展植物功能基因組研究的重要材料，目前已在擬南芥［14］，小麥［15］等多種植物中廣泛應(yīng)用，并在功能基因組學(xué)研究中發(fā)揮了重要的作用。本研究表明，低濃度的EMS有利于愈傷組織的生長和植株再生，這與樸鐵夫［16］的研究結(jié)果一致?？赡苁堑蜐舛鹊腅MS刺激細(xì)胞使呼吸作用加強，并且可提高細(xì)胞色素氧化酶活性。詹亞光［17］研究結(jié)果也表明，0.1%的EMS可促進白樺愈傷組織生長，并且建議用該濃度的EMS來促進白樺愈傷組織的分化。

3.2 EMS的濃度與材料大小和狀態(tài)有關(guān)

EMS誘變主要是功能基因的點突變，由于不同組織材料對EMS的敏感程度不同，所選材料將直接影響EMS的使用濃度和誘變頻率。本研究過程中發(fā)現(xiàn)，用0.8%EMS處理綠豆大小的劍麻愈傷組織6 h，愈傷組織死亡率為52.22±1.11%，處理黃豆大小的愈傷組織6 h，愈傷組織死亡率僅為37.8%;分化系數(shù)也明顯增加;另外繼代次數(shù)越多，愈傷死亡率也越高，可能原因是愈傷團塊越大，EMS只接觸了表面的細(xì)胞和組織，對里面的細(xì)胞的損傷力度越小，在后續(xù)的培養(yǎng)中容易復(fù)蘇，繼代次數(shù)越多，細(xì)胞活力下降，有的愈傷組織會出現(xiàn)衰老死亡或分化，EMS的損傷會增加，死亡率也增加。對于劍麻愈傷組織繼代時間以10－15 d為宜，這與羅靜［11］的研究結(jié)果基本一致，黃俊生［18］則認(rèn)為，對于菠蘿而言，繼代時間越長(5－30d)，對EMS的抵抗力也增強。詹亞光［17］在白樺的EMS誘變研究中建議將不同大小和繼代時間的愈傷組織分開進行處理，鑒于此，在進行EMS誘變處理時，應(yīng)針對不同的試驗材料，選取合適的濃度組合。

4 結(jié)語

本研究獲得了1，000多株劍麻EMS誘變植株并已成功移栽，表型觀察發(fā)現(xiàn)有的植株生長明顯比其它植株迅速，葉片較寬，染色體觀察未發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目的改變(數(shù)據(jù)未列出)，建議作進一步的表型觀察和細(xì)胞學(xué)分析，并且在以后的篩選工作中，最好能結(jié)合一些其他的方法，定向的篩選突變體，提高篩選效率，縮短育種周期。

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