亞麻脫膠微生物的篩選及應用研究

石杰，吳昌斌，姬妍茹，劉宇峰

(黑龍江省科學院大慶分院，大慶163318)

亞麻脫膠是亞麻加工過程的一個重要的環(huán)節(jié)，直接影響亞麻的長麻率、強度、分裂度等指標。目前，國外主要產麻國如法國、比利時等因環(huán)保等因素已完全由雨露脫膠取代了溫水脫膠工藝，溫水漚麻技術目前只有中國、埃及等少數國家仍在采用［1］。雨露漚麻工藝的特點是投資小、無環(huán)境污染、可連續(xù)機械化作業(yè)等，使其在歐州已完全取代溫水漚麻工藝，其產品特點是強度好。但雨露漚麻工藝受自然條件的制約很大，需要雨水和陽光的交替作用，并輔之以翻麻機對亞麻桿的反復晾曬［2］。近年來，隨著國家產業(yè)政策的調整和亞麻種植區(qū)域的北移，雨露麻是發(fā)展趨勢，這是環(huán)保政策的要求，也是節(jié)能、降低產品成本的綜合要求，這也是我國亞麻初加工行業(yè)發(fā)展的必然趨勢［3］。為了順應這一發(fā)展方向，同時解決雨露漚麻脫膠不均勻，以及工藝過程過長的問題，我們在微生物溫水脫膠研究技術的基礎上，開展了雨露麻的微生物脫膠工藝的研究。本文由亞麻雨露麻莖上分離篩選到兩株高產堿性果膠酶和半纖維素酶的細菌，將其用于亞麻漚麻工藝中，明顯縮短了漚麻時間，提高了出麻率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基礎材料

枯草芽孢桿菌Y1、Y2為本院分離保存;亞麻原莖來自亞麻研究所;化學試劑為分析純，分析用水為蒸餾水。

1.1.2 主要設備

Olympus生物顯微鏡，TG3288型分析天平，202－1型干燥箱。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基:果膠1%，蛋白胨0.2%，酵母膏0.1%，瓊脂粉1.0%。

普通培養(yǎng)基:牛肉膏1%，蛋白胨1%，酵母膏0.3%，氯化鈉0.5%。

發(fā)酵培養(yǎng)基:玉米粉 6%，豆粉 4%，Na2HPO40.4%，NaH2PO40.03%，Na2CO30.1%。

1.3 方法

1.3.1 菌種的分離

將收集到的雨露麻樣剪成段后分裝于大試管少許，加入10ml 0.85%NaCl的生理鹽水，經65℃加熱30min，稀釋涂布在普通固體培養(yǎng)基上，將生長的單菌落轉接到分離培養(yǎng)基上，過夜培養(yǎng)，用飽和乙酸銅染色15分鐘，挑出有透明圈的菌落，保存于斜面進行下一步試驗。

1.3.2 酶活力測定

酶活力單位定義為:50℃每分鐘水解糖醛酸1微克半乳糖醛酸所需的酶量［4－5］。

1.3.3 果膠酸裂解酶的測定方法

用50mmol/L的Tris－HCl(PH8.0)配制0.4%的聚半乳糖醛酸鈉和酶液置50℃進行酶底物反應。以不同時間間隔取樣，在721分光光度計535nm處測消光值［6－7］。

1.3.4 Y1、Y2在雨露脫膠過程中的效果研究

菌體數量為平板計數法，糖含量測定酸水解—DNS比色法。亞麻纖維化學測定，按“GB5889苧麻化學成分定量分析方法”中的規(guī)定進行。

減重率:亞麻原莖在漚麻處理前后的絕干重量損失的百分比，定義為減重率。

1.3.5 Y1、Y2 在雨露漚麻中的應用試驗

收獲的亞麻原莖噴灑1%的Y1、Y2混合菌液，進行雨露漚麻。

2 結果

2.1 菌種的鑒定

從雨露麻篩選出2株產果膠酶的耐堿性芽孢菌，生長較快，并定名為Y1、Y2［9］。對 Y1、Y2進行形態(tài)觀察，并對其多項生理、生化指標進行了分析研究，確定為枯草芽孢桿菌［5］，結果見表1。

Y1、Y2在普通的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長良好但不產生色素(圖1)，菌落污白色，邊緣不整齊，表面有皺褶，表面干燥，菌落中部凹陷，四周凸起，在斜面上培養(yǎng)時生長良好，呈峽谷狀。如表1所示，Y2比Y1更耐高溫環(huán)境。在營養(yǎng)瓊脂上生長48hr的Y2，在顯微鏡下觀察時，革蘭氏染色陽性，呈長桿狀，多數單生，極少量兩桿直線相連，近中生芽孢，卵圓形，不膨大(圖2);在水片的顯微鏡觀察時，菌體有運動性，表明鞭毛的存在。

圖1 目的菌株在營養(yǎng)瓊脂平板上生長形態(tài)(48hr)Fig.1 Colonial morphology of the screened strain on nutrient agar plate(cultured for 48 h)

圖2 目的菌株在營養(yǎng)瓊脂上生長48hr后的菌體形態(tài)Fig.2 Cell morphology of the screened strain on nutrient agar(cultured for 48 h)

表1 枯草芽孢桿菌Y1、Y2的形態(tài)、生理、生化特征Tab.1 Morphological，physiological and biochemical traits of Bacillus subtilis Y1，Y2

2.2 菌種的部分性質

2.2.1 不同溫度對酶活的影響

枯草芽孢桿菌Y1、Y2在發(fā)酵培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)48小時后，按1:1混合做為待測液，置于不同溫度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)分別反應 10min，測定酶活。結果表明，30－40℃酶活可達85%，50－60℃度之間可達相對酶活的最大值。

圖3 溫度對酶活力的影響Fig.3 Influence of temperatures on enzyme activity

2.2.2 溫度對酶穩(wěn)定性的影響

將待測稀釋的酶液分別在50℃和60℃水浴中保溫，每隔10min測定酶的活力。結果表明，50℃保溫50min酶活保留60%活性，60℃保溫50min只保留10%的酶活性。

圖4 溫度對酶穩(wěn)定性的影響Fig.4 Influence of temperatures on enzyme stability

2.2.3 不同pH對活性的影響

配制不同pH緩沖液，pH3－6(0.1 mol/L檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液);pH7－9(0.4mol/L巴比妥鈉－鹽酸緩沖液);pH9－10.6(0.05mol/L甘氨酸－氫氧化鈉緩沖液);pH11－12(碳酸鈉－氫氧化鈉緩沖液)。將不同pH值的反應體系置于50℃保留10min，測定酶活。結果表明pH9.0時，酶活性最高。

圖5 pH值對酶活力的影響Fig.5 Influence of pHs on enzyme activity

2.3 枯草芽孢桿菌Y1在亞麻浸提液中的生長

為便于考察亞麻原莖脫膠菌的生長情況，研究中使用65℃的溫水，以1:10的麻水比對亞麻原莖進行4hr的浸提，浸提液的成分分析結果列于表2。

表2 亞麻原莖浸提液的成分Tab.2 Components in flax extraction solution

從以上結果可以看出，麻莖中可溶物中有一定量的碳氮磷等生物生命所需養(yǎng)分，可以滿足細菌的早期生長。進一步的研究證明，漚麻過程中適量補充氮源可以促進枯草芽孢桿菌Y1和Y《》2的生長。

表3 枯草芽孢桿菌Y1在亞麻浸提液中的生長Tab.3 Cell numbers of Bacillus subtilis Y1 reproduced in flax extraction solution

2.4 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Y1、Y2在亞麻脫膠過程中的作用

為方便研究，采用溫水漚麻方法來研究Y1、Y2在亞麻脫膠過程中的作用。浸沒在10倍含0.4%尿素水中的亞麻原莖，在0.8kg/cm2的壓力下滅菌處理，隔天再進行一次滅菌，接種Y1、Y2進行漚麻試驗，以不接種的為對照試驗，40小時后檢查結果(表4)。接種脫膠菌劑處理原莖的減重率為9.87%，比對照試驗的5.82%高1.7倍，而原莖中殘果膠含量也由對照處理后的3.92%下降到 1.45%。

表4 枯草芽孢桿菌Y1對亞麻原莖的脫膠作用Tab.4 Degumming results of flax stem with Bacillus subtilis(Y1)

漚麻過程中，脫膠菌活動前期主要在漚麻液中進行，至12小時后原莖中開始出現菌體，直至48小時后數量上達到高峰(圖6)。經過漚麻處理的原莖，摻雜在纖維中的各種近橢圓形的顆粒(果膠顆粒)明顯減少(圖7)，表明果膠類物質已經隨漚麻過程的進行而被溶出。

圖6 亞麻韌皮纖維中的微生物菌體Fig.6 Bacteria spreading in the flax bast fiber

圖7 亞麻纖維中的雜質Fig.7 Impurities in flax fiber before and after treatment

2.5 滲透劑對枯草芽孢桿菌作用效果的影響

滲透劑的作用是降低水的表面張力，提高水向麻莖內的浸漬速度，一方面加速原莖中的可溶性物質的溶出，促進微生物制劑中微生物的活動增強;另一方面也使微生物能更迅速地進入并定植在原莖的內部，促進果膠等不溶物質的溶出。本試驗中的滲透劑是采用黑龍江省化工研究院研制生產的專業(yè)用于亞麻產品的H－901高效滲透劑，H－901以0.1%的量加入0.2%濃度的菌液中，顯微觀察表明在8－12小時內韌皮中微生物開始出現，而對照樣品在18－24小時后有微生物出現。

2.6 菌劑對雨露漚麻的影響

由于雨露麻受到氣侯的影響較大，如果以較低的微生物濃度噴灑，則微生物要經過增殖培養(yǎng)才能達到產酶的過程，從而完成脫膠，受溫濕度的限制，這個過程會很長。通過以上的研究，課題組確定了如下試驗方案，采用高含菌量的菌劑，含菌量達到1%，Y1與Y2的比例在4:6之間，同時加入0.1%的H－901高效滲透劑。復合脫膠菌液對原莖脫膠，在保持濕度和15℃的室溫條件下，可在190小時內完成脫膠過程。與對照脫膠時間大于480小時相比。相對比較脫膠時間減少50%以上。

生產試驗在亞麻廠種植地中進行，以原工藝條件為對照試驗，試驗面積為600平方米，約為400 kg原莖。菌液中含1%的Y1、Y2，二者的比例為1:1，同時加入千分之一的滲透劑H－901，采用噴藥機噴灑，噴灑量為每公頃600kg。生產試驗結果表明，復合菌的使用，達到了縮短漚麻時間，提高出麻率的目的。雨露漚麻由平均30－40天降為15天以內，縮短幅度達50%以上。對比對照試驗的結果，亞麻的長麻出麻率提高2個百分點，綜合出麻率提高1個百分點以上。

2.7 菌液對環(huán)境指標的影響

枯草芽孢桿菌Y1、Y2的加入，加速了脫膠進程和脫膠效果，增強了亞麻原莖中目的微生物的豐度和活動強度，使脫膠過程中有機質的分解更快、更徹底。由于枯草芽孢桿菌是公認的對環(huán)境無污染的微生物，同時加入的0.1%量的滲透劑是可降解的環(huán)保形產品，所以從環(huán)境因素考慮，所添加的脫膠菌劑不會對環(huán)境造成新的污染。

3 結論與討論

在以往的研究當中［9，10］，枯草桿菌Y1、Y2產生果膠酶屬于聚半乳糖醛酸裂解酶(PGL)，還有半纖維素酶，其中Y1主產果膠酶，果膠酶活性可達10000U/ml，和少量的半纖維素酶。Y2主產半纖維素酶和少量果膠酶，Y1、Y2均不產纖維素酶，兩種菌可產生麻類脫膠所需的果膠酶和半纖維素酶，而不產纖維素酶，這些特點均適合麻類脫膠在生產中的應用。

對亞麻原莖提取液的成分分析和進行的枯草桿菌Y1、Y2的培養(yǎng)結果表明，在補充0.4%的尿素條件下，枯草桿菌Y1、Y2能夠在漚麻液中生長和繁殖，并分泌果膠酶和半纖維素酶，完成亞麻的脫膠過程。在不添加尿素的情況下，增加微生物的加入量，同樣可加速亞麻雨露脫膠的過程。這實際上是菌液中的果膠酶和半纖維素酶起了主要作用。同時脫膠后的麻纖維達到了雨露麻的各項指標。

在雨露漚麻過程中使用復合菌劑，明顯地縮短了漚麻時間，同時亞麻原莖的混合出麻率和長出麻率都有所提高。同時，與傳統工藝相比，工藝過程無明顯改動，實施過程中不需添置新的設備，易于應用，易于被企業(yè)接受，由于麻率的提高和麻質的改善，可以提高企業(yè)的產品附加值和產品的穩(wěn)定性。

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