不同加工方法杜梨葉中鞣質(zhì)的含量測定

王瑞華，侯彩婷，鄒昀員，田易玲，劉玉紅，徐凌川

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南250355)

杜梨(Pyrus betulaefolia Bge.)為薔薇科梨屬落葉喬木，又名棠梨、海棠梨、野梨子、土梨，常作為庭蔭樹、防護(hù)林種植于園林及作為砧木［1］。杜梨各個部分均有保健價值［2］，其果實入藥，具有消食止痢、治腹瀉之效;枝、葉入藥可治霍亂、吐瀉不止、轉(zhuǎn)筋腰痛、反胃吐食;樹皮入藥可治皮膚潰瘍。鞣質(zhì)又稱單寧，是保證杜梨色、香、味的一個重要成分，是一類比較復(fù)雜的具有沉淀蛋白質(zhì)性質(zhì)的水溶性多元酚類化合物，廣泛存在于植物中。近些年來，隨著分析、分離手段及活性成分研究的進(jìn)步，逐漸發(fā)現(xiàn)鞣質(zhì)具有許多保健價值［2］及藥理活性［3］，可以抗脂質(zhì)過氧化［4］、清除活性氧［5］，且具有抗艾滋病病毒(HIV)［6］和抗腫瘤［7］等作用，臨床應(yīng)用日益受到重視。

目前關(guān)于杜梨的研究主要集中在種子、幼苗［8－9］，作為砧木嫁接梨樹，杜梨葉氨基酸、礦質(zhì)元素含量測定［10］，多糖［11］、根皮苷［12］、總黃酮［13］及杜梨果實揮發(fā)油含量測定［14］等方面，本實驗測定了不同加工方法杜梨葉中的鞣質(zhì)含量，為其加工方法選擇及開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品:杜梨葉1#為日曬夜露傳統(tǒng)制法的干燥品，杜梨葉2#為經(jīng)過渥堆發(fā)酵后的干燥品，均為湖南省白沙溪茶廠有限責(zé)任公司質(zhì)檢部提供，粉粹后過40目篩;沒食子酸對照品(批號 110831-200803，純度按含C7H6O5計為90.1%，供含量測定用)由中國藥品生物制品檢定所提供;其它試劑均為分析純;磷鉬鎢酸試液的配制［15］:取鎢酸鈉100 g，鉬酸鈉25 g，加水700 mL使溶解，加鹽酸100 mL，磷酸50 mL，加熱回流10 h，放冷，再加硫酸鋰150 g，水50 mL和溴0.2 mL，煮沸除去殘留的溴(約15 min)。冷卻，加水稀釋至1 000 mL，濾過，即得。本液不得顯綠色(如放置后變?yōu)榫G色，可加溴0.2 mL，煮沸除去多余的溴即可)。

1.2 儀器與設(shè)備

Varian Cary 100紫外－可見分光光度計美國瓦里安公司;KQ500E超聲儀，江蘇昆山超聲儀器有限公司;FA1104萬分之一電子天平，上海精密儀器公司;FW-100高速萬能粉碎機，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

1.3.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸對照品5 mg，置100 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取5 mL，置50 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含沒食子酸0.05 mg)。

1.3.1.2 供試品溶液的制備

分別取不同加工方法的杜梨葉粉末3.5 g，精密稱定，置250 mL棕色容量瓶中，加水150 mL，放置過夜，超聲處理10 min，放冷，用水稀釋至刻度，搖勻，靜置(使固體物沉淀)，濾過，棄去初濾液50 mL，精密量取續(xù)濾液20 mL，置100 mL棕色容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.2 吸收波長的測定

取對照品和供試品溶液各2.0 mL，分別置25 mL棕色容量瓶中，各加入磷鉬鎢酸試液l mL，再分別加水10 mL，用29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。以相應(yīng)的試劑為空白，于200～800 nm處掃描即得。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對照品溶液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置 25 mL 棕色容量瓶中，編號依次為 1 ～6號，各加入磷鉬鎢酸試液 1 mL，再分別加水 11.5，11，10，9，8，7 mL，用 29%碳酸鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，放置30 min。以相應(yīng)的試劑為空白，參照紫外－可見分光光度法［15］，在吸收波長下測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)線。

1.3.4 精密度實驗

取4號對照品顯色后溶液，吸收波長處測定吸光度，連續(xù)測定6次，在最大吸收波長處測定吸光度，計算RSD值。

1.3.5 穩(wěn)定性實驗

取同一批供試品，按供試品溶液的制備方法操作，吸收波長處測定吸光度，每隔若干時間測定一次，連續(xù)考察3 h，共測定6次，計算RSD，分析供試品溶液的穩(wěn)定性。

1.3.6 重復(fù)性實驗

取杜梨葉1#粉末，依上述方法處理樣品6份，按樣品含量測定方法測定，計算RSD，觀察其重復(fù)性。

1.3.7 加標(biāo)回收實驗

取已知鞣質(zhì)含量的供試品(杜梨葉1#粉末2.3 g)6份，精密稱定量，置250 mL棕色容量瓶中，分別加入近等量的沒食子酸對照品，按供試品溶液制備及1.3.9樣品測定方法測定，并計算鞣質(zhì)的平均回收率及RSD。

1.3.8 最低檢測限和定量限

該方法測定最低檢測限為 0.17 μg/mL，定量限為 0.51 μg/mL。

1.3.9 樣品含量測定

總酚:精密量取供試樣品溶液2 mL，置25 mL棕色容量瓶中，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL。依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)并計算，即得。

不被吸附的多酚:精密量取供試品溶液25 mL，加至已盛有干絡(luò)素0.6 g的100 mL具塞錐形瓶中，密塞，置30℃水浴中保溫1 h，時時振搖，取出，放冷，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密量取續(xù)濾液2 mL，置25 mL棕色容量瓶中，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL，依法測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出供試品溶液中沒食子酸的量(mg)并計算，即得。

按下式計算鞣質(zhì)的含量:鞣質(zhì)含量=總酚量－不被吸附的多酚量。

2 結(jié)果

2.1 吸收波長的測定

對照品溶液及樣品溶液在760 nm處均有最大吸收，故確定其吸收波長為760 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在760 nm下測定對照品溶液吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得回歸方程為:Y=0.0009X+0.004 1，r=0.997 9，結(jié)果表明沒食子酸在1～10 μg/mL之間呈良好線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

2.3 精密度實驗

在波長760 nm處測定吸光度，RSD=0.31%(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實驗

待供試品溶液顯色后，在760 nm下測定吸光度，每隔若干時間測定一次，連續(xù)考察3 h，共測定6次，結(jié)果表明供試品溶液顯色后在30 min內(nèi)吸收度上升較大，在30～60min內(nèi)吸光度穩(wěn)定，吸光度RSD=0.47%。表明供試品溶液在30～60 min穩(wěn)定，故選擇在30～60 min內(nèi)測定。

2.5 重復(fù)性實驗

供試品溶液顯色后，在760 nm下按樣品含量測定方法測定吸光度，RSD=1.27%(n=6)，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.6 加標(biāo)回收實驗

已知鞣質(zhì)含量的供試品溶液加入近等量的對照品，在760 nm下按供試品溶液制備及1.3.9項下樣品測定方法測定，計算得鞣質(zhì)的平均回收率為98.58%，RSD=0.51%(n=6)。結(jié)果見表1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of gallic acids

表1 加標(biāo)回收實驗結(jié)果Table 1 Spike recovery rate of tannin in the leaves of Pyrus betulaefolia Bge.and RSD

2.7 樣品中鞣質(zhì)的含量測定

供試品溶液顯色后，在760 nm下按樣品含量測定方法測定吸光度，杜梨葉1#鞣質(zhì)含量為0.58% ～0.62%，鞣質(zhì)平均含量為0.60%，RSD=2.64%(n=5);杜梨葉2#未檢測出鞣質(zhì)。結(jié)果表明，傳統(tǒng)制法的杜梨葉鞣質(zhì)含量高于渥堆發(fā)酵后的。樣品中鞣質(zhì)的含量測定結(jié)果見表2。

表2 不同加工方法杜梨葉中鞣質(zhì)的含量測定結(jié)果Table 2 Determination result of tannin in the leaves of Pyrus betulaefolia Bge.with different processing methods

3 討論

現(xiàn)有中藥鞣質(zhì)的含量測定方法比較多，最常見的有皮粉法、干絡(luò)素法、絡(luò)合量法、比色法和磷鉬鎢酸－干絡(luò)素法［16］。皮粉法是現(xiàn)在國際上較公認(rèn)的測定方法，但樣品耗用量大，測定時間長且無選擇性，測定結(jié)果往往偏高，一般只適用于鞣質(zhì)含量較高的生藥，而且皮粉試劑的供應(yīng)和質(zhì)量都較難保證。磷鉬鎢酸－干絡(luò)素法專屬性強，重復(fù)性及靈敏度高，實驗周期短，操作簡單［17］。2005及2010年版《中華人民共和國藥典》中鞣質(zhì)含量測定方法皆為磷鉬鎢酸－干絡(luò)素法，故本實驗選擇該方法測定杜梨葉中的鞣質(zhì)含量。由于鞣質(zhì)易氧化，所以實驗應(yīng)在避光條件下操作。因鞣質(zhì)受熱不穩(wěn)定，故選用室溫浸提過夜提取。

本實驗結(jié)果表明，不同加工干燥方法所測得杜梨葉中鞣質(zhì)含量有所不同，其中未發(fā)酵杜梨葉中鞣質(zhì)平均含量為0.60%，渥堆發(fā)酵干燥的杜梨葉檢測到有信號，但未測出鞣質(zhì)含量。原因可能是杜梨葉在渥堆發(fā)酵加工過程中的高溫使其鞣質(zhì)發(fā)生一系列的氧化、聚合、縮合反應(yīng)，產(chǎn)生大量的水溶性氧化產(chǎn)物(主要是色素類多酚)和非水溶性轉(zhuǎn)化物(主要是與蛋白質(zhì)結(jié)合的不溶性大分子物質(zhì))［18］，使發(fā)酵后杜梨葉中的多酚類物質(zhì)減少，致使鞣質(zhì)含量極低，不易檢測出;另一方面在渥堆發(fā)酵過程中經(jīng)微生物的作用，鞣質(zhì)降解，但具體原因還有待進(jìn)一步研究。因此，在選擇這兩種加工方法時，如果杜梨葉煎煮后的口感和色澤差別不大，宜選擇日曬夜露傳統(tǒng)的加工方法。

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