人蛋白酶體α亞基3型 （PSMA3）對促細胞凋亡蛋白分子Bim的影響

鄢 進 （武漢大學基礎醫(yī)學院，湖北 武漢430071；復旦大學生命科學院，上海200433）

陳金中，王臻臻，夏 鵬 （復旦大學生命科學院，上海200433）

黎七雄 （武漢大學基礎醫(yī)學院，湖北 武漢430071）

蛋白酶體能抑制細胞凋亡，而蛋白酶體抑制劑MG132誘導人血管內(nèi)皮細胞凋亡［1－3］。PSMA3基因在Bim凋亡調(diào)節(jié)蛋白起什么作用，有何影響，目前尚未見文獻報道。因此，本研究的主要目的是探究PSMA3基因在Bim蛋白中的調(diào)節(jié)作用，研究PSMA3調(diào)節(jié)Bim蛋白對細胞凋亡的影響，闡明蛋白酶體與細胞凋亡的關(guān)系，為研究蛋白酶體抑制劑有效的刺激或誘導細胞Bim的表達水平上調(diào)，為疾病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品及試劑 QIAquick的膠回收試劑盒，由德國的Qiagen公司提供；QIAquiekPCR的純化試劑盒，由德國的Qiagen公司提供；硝基纖維素膜 （Hybond－C），由美國Amersham Pharmacia Biotech公司提供；常規(guī)質(zhì)粒的快速提取的試劑盒，由北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司提供；DNA片段／PCR產(chǎn)物的快速純化以及回收試劑盒，由北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司提供。

使用的電泳各項試劑均系Bio－Rad產(chǎn)品；純化蛋白使用的瓊脂糖凝膠珠Ni－NTTA由Novegen公司提供；DNA與蛋白Markers由New England Biolabs公司提供；各種內(nèi)切酶如EeoRI、BamHI、Xhol、Hindlll等，T4DNA的連接酶，由英國Biolab公司提供；過硫酸胺，由美國Sigma公司提供；考馬斯亮藍的R250／G250，由美國AMRESCO公司提供；兔抗人的bimL的多克隆抗體，由美國Santa Cruz公司提供；兔抗人的PSMA3的多克隆抗體，由美國Santa Cruz公司提供；分析純，Tris堿，由美國Boehringer Mannheim公司提供；Dulbecco's modified Eagle's medium （DMEM）由美國 Gibco公司提供；其他的常用試劑是國產(chǎn)分析純試劑dNTPs，由上海生工生物工程公司提供。分子量蛋白標準，由中國科學院上海生化所提供；TaqDNA的聚合酶，由上海生工生物工程公司提供。以上所有的引物都是由上海賽百盛公司合成。

大腸桿菌的DH5菌株：基因型SupE44，pcDNA3.0，由美國的Invitrogen公司提供；pcDNA4／myc－h(huán)is的系列，由美國的Invitrogen公司提供；綠熒光表達的載體pEGFP－Cl，由美國的Clonteeh公司提供；真核表達的載體pcDNA系列，由美國的Invitrogen公司提供；紅熒光表達的載體pDsRedl－N1，由美國的Clonteeh公司提供；HEK293、PSMA3及BIM由復旦大學遺傳學國家重點實驗室提供。

1.1.2 主要儀器 哈爾濱 HZQ－C搖床，德國 Mastercyclergradien Eppendorf PCR儀，日本Olympus顯微鏡，上海 HHS－U99水浴鍋，日本 Hitachi 20PR－52D離心機，美國550Bio－Rad酶標儀，德國Eppendorf 5415DEppendorf臺式離心機，上海SDJ超凈工作臺，美國Power3000Xi Bio－Rad蛋白電泳儀，美國Mini－100Bio－Rad蛋白電泳槽。生物電泳凝膠成像及掃描分析軟件：Smart View3.0.Origin Pro6.0software.Annutating Grabber－1T2.51及 UVP Gelworks ID Advanced Version。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 在37℃，5%CO2的環(huán)境下用培養(yǎng)皿，將10%胎牛血清加入到含雙抗的DMEM的培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)293T細胞。

1.2.2 真核表達載體的構(gòu)建 PSMA3的基因首先設計特異引物通過PCR擴增，再將PCR的產(chǎn)物純化，經(jīng)過雙酶切，包括真核表達的載體也要進行雙酶切，酶切以后通過連接轉(zhuǎn)化，再做陽性克隆鑒定，最后送公司進行測序和分析［4］。

1.2.3 質(zhì)粒的小量提取 對篩選的單克隆菌落的小瓶培養(yǎng)菌液，吸取1.5ml菌液，放在Ep管中，12000g，離心2min，取菌體沉淀。加入SolutionⅠ100μl，用移液器吹打沉淀，直到打散為止。加入SolutionⅡ200μl，輕混搖勻，冰浴5min。加入SolutionⅢ150μl，振蕩混勻，冰浴5min。12000g，離心2min，吸取400μl上清液，轉(zhuǎn)移在新的Ep管中，加880μl無水乙醇，混勻室溫放5～30min。12000g，離心2～5min，棄去上清液，用70%的乙醇清洗得到的DNA，棄上清，室溫干燥后，加入TE緩沖液溶解20μl，4℃保存。

1.2.4 其他 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染、亞細胞定位、細胞蛋白抽提、Western blot檢測和免疫共沉淀方法均按文獻 ［4］操作。

2 結(jié) 果

2.1 應用PlexA－bimL技術(shù)從人胎腦PB42AD文庫篩選PSMA3

常見的3個Bim異構(gòu)體：Bim S／L／EL，三者的促凋亡作用依次減弱，在細胞內(nèi)Bim主要是以BimL／EL的形式存在。我們在研究過程中選用促凋亡效應中等的Bim L來進行研究。從人胎腦pB42AD文庫中篩選到121個陽性克隆，其中陽性克隆出現(xiàn)超過一次以上的基因有下列11個，經(jīng)過測序驗證，和Blastn基因庫數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)，它們所代表的基因分別為：MIF、PMSB4，GRB10、PMSA3、 Ferritin Heavy Chain、 TUBB5、 CTBP2、 CGI99、 SART3、S100、LOC199990（見表1）。

表1 人胎腦PB42AD文庫篩選PSMA3結(jié)果

我們對其中的NM－002788所代表的人蛋白酶體亞基產(chǎn)生了濃厚的興趣。此基因位于1q21，mRNA為1014bp，含有7個外顯子，編碼的蛋白是30KD大小，且主要分布于細胞的胞核、胞漿中，主要執(zhí)行蘇氨酸內(nèi)肽酶的分子功能，在生命過程中參與泛素依賴性的蛋白分解代謝。

2.2 光共聚焦測定PSMA3和Bim胞質(zhì)的分布

用pEGFP－C1－BimL／pDsRed－PSMA3在HEK293T中過表達檢測亞細胞定位情況，如圖1所示，在同一視野不同的熒光下拍攝的照片，可以看出pEGFP－C1－BimL轉(zhuǎn)染效率要高于pDsRed－PSMA3。在共轉(zhuǎn)染的細胞中，熒光顯示Bim在細胞胞質(zhì)中分布，而PSMA3則是顆粒狀的分布在細胞胞質(zhì)中，融合蛋白主要分布在細胞核核膜的周圍。熒光共聚焦實驗提示，PSMA3和Bim在細胞內(nèi)的空間上存在相互作用可能性。

圖1 熒光共聚焦測定PSMA3和Bim胞質(zhì)的分布

2.3 PSMA3對Bim蛋白表達的影響

實驗組將質(zhì)粒PEGFP－BimL／pCMV－MYC－PSMA3共轉(zhuǎn)入 HEK293T細胞，對照組共轉(zhuǎn)pEGFp－BimL／pCMV－MYC，proteinA／G用兔抗pEGFP抗體孵育，免疫沉淀pEGFP－BimL，用鼠抗MYc抗體檢測MYc－PSMA3。PSMA3能增加HEK293t細胞胞質(zhì)中Bim L的表達，同時，胞內(nèi)過表達的Bim L能與過表達的PSMA3也存在相互作用。

3 討 論

細胞凋亡是一種進化保守的細胞死亡形式，不僅在正常的生理狀態(tài)具有重要作用，而且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來研究認為，細胞凋亡異?？赡芘c腫瘤發(fā)生有關(guān)。凋亡調(diào)控基因已被看作是一類新的腫瘤發(fā)生相關(guān)基因。腫瘤的發(fā)生是由于細胞增殖與細胞凋亡之間的平衡失調(diào)的結(jié)果，細胞凋亡在腫瘤生長過程中起負調(diào)控作用，因此，研究抑制多種腫瘤細胞增殖并誘導細胞凋亡而對正常細胞影響不大是腫瘤治療的新思路［5－6］。

為了研究線粒體依賴性凋亡過程中Bim潛在的分子調(diào)節(jié)機制，通過篩選胎腦文庫，克隆到一個未曾報道過的并能與Bim相互作用的蛋白分子——人蛋白酶體α亞基3型 （PSMA3）。應用顯微共聚焦和免疫共沉淀的技術(shù)，我們證實了PSMA3和Bim在細胞內(nèi)的分布，它們之間存在相互作用并可能具有功能上的聯(lián)系。在HEK293細胞內(nèi)，可檢測到內(nèi)源性的PSMA3和Bim的復合物，尤其是凋亡信號刺激下的細胞。我們在實驗中還發(fā)現(xiàn)，在HEK293亞細胞中顯示PSMA3和Bim共定位、共表達，PSMA3可以一定程度上增加Bim表達而誘導的細胞凋亡。隨著細胞凋亡機制的深入研究，人們對細胞凋亡機制的認識會更加深入。由于Bim的表達和調(diào)節(jié)具有細胞類型特異性，因而應用有效的誘導腫瘤細胞中Bim的表達水平上調(diào)可為腫瘤的治療提供一個新的思路。

本研究初步發(fā)現(xiàn)，PSMA3對BIM介導的細胞凋亡具有一定的調(diào)節(jié)作用，這只是研究中的一點線索，PSMA3與Bim介導的細胞凋亡之間存在何種關(guān)系還需要進一步而大量的研究來探究。