用異源蛋白和蛋殼體外培養(yǎng)鵪鶉胚胎的研究

張文昌，李玉芳，莊益芬*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 黃淮學(xué)院，河南 駐馬店 463000)

轉(zhuǎn)基因是禽類抗病育種和改善禽產(chǎn)品質(zhì)量的快捷手段。而且禽類飼養(yǎng)成本低，繁殖能力高，轉(zhuǎn)基因禽類可迅速擴(kuò)群，禽蛋蛋白質(zhì)含量高，表達(dá)的外源蛋白容易收集、保存、不易感染，作為生物反應(yīng)器具有很大的優(yōu)勢(shì)。禽類轉(zhuǎn)基因有很多途徑，其中多數(shù)基因的轉(zhuǎn)染、整合效率、表達(dá)水平低，只有病毒載體法[1]和顯微注射法[2]比較成功地獲得了轉(zhuǎn)基因雞。

禽類胚胎發(fā)育過程特殊，離開卵巢的卵母細(xì)胞在母體輸卵管內(nèi)受精并開始卵裂，排出體外時(shí)胚盤內(nèi)已含有數(shù)以萬計(jì)的細(xì)胞，此后在一定條件下，胚胎在體外蛋殼內(nèi)發(fā)育成雛。禽蛋結(jié)構(gòu)也獨(dú)特復(fù)雜，卵黃大，卵子嵌在卵黃上，卵黃不透明，受精時(shí)多精入卵，形成多個(gè)雄原核，與雌原核融合的雄原核難以判斷?？梢娗菖唧w外培養(yǎng)技術(shù)對(duì)準(zhǔn)確高效地實(shí)施卵子和早期胚胎轉(zhuǎn)基因操作是至關(guān)重要的。同時(shí)禽類體外培養(yǎng)也是核移植、胚胎移植、體外受精以及胚胎冷凍等生物技術(shù)實(shí)施的重要環(huán)節(jié)。

禽胚體外培養(yǎng)技術(shù)的研究已有一百多年的歷史，直到1984年Ono和Wakasugi 把正常孵化了2.5 d 的鵪鶉種蛋的除去殼以外的其他部分，原原本本地直接移入雞蛋殼內(nèi)培養(yǎng)，93例中有3例出雛[3]。1988年P(guān)erry綜合前人研究的基礎(chǔ)上，首次成功地將外部已包被了濃蛋白的雞單細(xì)胞受精卵，保留濃蛋白，補(bǔ)充培養(yǎng)液，體外培養(yǎng)成雞雛，實(shí)現(xiàn)了禽類完全體外培養(yǎng)的突破[4]。迄今為止，很少有人從事禽類胚胎脫離自然包裹在卵黃外部的蛋白，“裸黃”狀態(tài)下培養(yǎng)的研究，而這種研究成果恰恰最便于進(jìn)行禽類轉(zhuǎn)基因等生物操作。我國(guó)雞體外培養(yǎng)的研究還停留在以種蛋產(chǎn)出體外的胚胎為起點(diǎn)的水平上[5-8]，而鵪鶉體外培養(yǎng)尚無成功的報(bào)道。

雞種蛋產(chǎn)出體外胚胎的培養(yǎng)都是以雞的稀蛋白作為補(bǔ)充培養(yǎng)液的，鵪鶉蛋小，稀蛋白量少而粘稠，不宜提取。本試驗(yàn)擬探討鵪鶉種蛋產(chǎn)出體外胚胎不經(jīng)自然孵化，去除自然形成的蛋白，以易于提取的雞的稀蛋白作培養(yǎng)液體外培養(yǎng)的方法，為禽胚胎操作提供方便。

1 材料與方法

1.1 器材及消毒用品

孵化器(QFC-552，江蘇無錫東北塘孵化機(jī)場(chǎng))，凈化工作臺(tái)(CJ-PT-102A，雞西無線電專用設(shè)備廠)，簡(jiǎn)易天平，鋼鋸鋸條，剃須刀片，保鮮膜，中間留有圓孔的方形薄木板，皮套，新潔爾滅，75%酒精。

1.2 種 蛋

采用中國(guó)白羽鵪鶉新鮮種蛋，在當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶預(yù)定并購(gòu)進(jìn)100枚，從中選擇50個(gè)胚胎進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 培養(yǎng)液

用當(dāng)?shù)氐峡ǖ半u商品蛋中分離提取的稀蛋白。

1.4 代用蛋殼

實(shí)驗(yàn)過程中換殼2次，種蛋換殼培養(yǎng)2.5 d再行換殼。2次換殼所用代用蛋殼均來自當(dāng)?shù)仉u場(chǎng)剛剛開產(chǎn)的迪卡蛋雞商品蛋。代用蛋殼用鋼鋸鋸條和剃須刀片開口，口徑約為2.0 cm。第1次換殼所用代用蛋殼去掉了雞蛋的銳端，作殼蛋比種蛋重5 g以上，第2次換殼所用代用蛋殼在雞蛋的鈍端開口，作殼蛋比種蛋約重15 g。

1.5 禽蛋消毒

先用20 ℃左右的清水洗去種蛋、作殼和作培養(yǎng)液用蛋表面的污垢，再用同溫的1%的新潔爾滅浸泡3 min，使用前用75%的酒精擦拭蛋殼。

1.6 換殼處理

換殼過程在凈化工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。打開種蛋，剝離蛋白，把帶有胚胎的裸黃小心地放入裝有少量培養(yǎng)液的銳端開口的代用蛋殼內(nèi)，再用同種培養(yǎng)液將蛋殼注滿，開口用經(jīng)滅菌的市售保鮮膜密封后，固定在中間留有圓孔的兩塊薄木板上，放入孵化器中培養(yǎng)。2.5 d后將內(nèi)容物直接移入鈍端開口的代用蛋殼中，培養(yǎng)液留量以與種蛋稀、濃蛋白總量相當(dāng)為宜，開口仍用保鮮膜封好，膜與培養(yǎng)液間留出一定空間，作為人工氣室，再放回孵化器培養(yǎng)至出雛。

1.7 胚胎培養(yǎng)

表1 鵪鶉胚胎培養(yǎng)條件Table 1 Conditions for the quail embryo culture

胚胎培養(yǎng)條件見表1。為保證鵪鶉胚胎正常呼吸，當(dāng)鵪鶉胚胎啄殼，喙伸入氣室時(shí)，在保鮮膜上鉆一些小孔，待胎膜上血管枯萎時(shí)將封口保鮮膜揭掉，以培養(yǎng)皿取而代之，避免殼內(nèi)水分快速增發(fā)。

1.8 繁殖能力測(cè)定

孵化出的雌雄鵪鶉同群飼養(yǎng)，產(chǎn)蛋階段公母鵪鶉本交，鵪鶉蛋用于孵化，以測(cè)定用本方法孵化出鵪鶉的繁殖能力。

2 結(jié) 果

不同培養(yǎng)階段鵪鶉胚胎的存活數(shù)和存活率見表2。2.5 d換殼時(shí)，50個(gè)處理胚珠周圍都有血管出現(xiàn)，由于胚胎與代用蛋殼粘連，有4例卵黃破裂，換殼后不久又有3例停止了發(fā)育，15 d以后是胚胎死亡高峰階段，夭折的25例胚胎都已成形，有些已經(jīng)開始啄殼，但尿膜絨毛膜不完整，代用蛋殼銳端有少量蛋白殘存，卵黃處于腹內(nèi)、腹外各半的狀態(tài)。孵化出的14只雛鶉有3只弱雛，其中1只跛行。育成4只公鶉和5只母鶉均有繁殖能力。

表2 不同培養(yǎng)階段鵪鶉胚胎的存活數(shù)和存活率Table 2 The number and rate of surviving the quail embryos in different stage of culture

3 討 論

3.1 異源蛋白對(duì)鵪鶉胚胎體外培養(yǎng)的影響

來自種蛋的鵪鶉胚胎處于裸黃狀態(tài)，更便于胚胎操作，而培養(yǎng)裸黃上的胚胎，首先要解決培養(yǎng)液的問題。雞種蛋產(chǎn)出體外階段的胚胎直接裸黃培養(yǎng)成功的先例，是用雞的稀蛋白作培養(yǎng)液的[5]，使用濃蛋白卵黃難于完全浸入，不利于胚胎與培養(yǎng)液充分接觸，同時(shí)卵黃偏于一側(cè)移動(dòng)受阻，極易與蛋殼粘連。鵪鶉稀蛋白微乎其微，近于不能提取。本試驗(yàn)用與鵪鶉不同種禽類雞的稀蛋白作鵪鶉胚胎培養(yǎng)液，出雛率達(dá)28%(14/50)，而且這些鵪鶉也已有了后代，沒有出現(xiàn)排斥反應(yīng)，也沒有影響鵪鶉的繁殖能力，可見用雞稀蛋白培養(yǎng)鵪鶉胚胎是可行的，這是禽類體外培養(yǎng)的一條新路。

3.2 代用蛋殼對(duì)鵪鶉胚胎體外培養(yǎng)的影響

本試驗(yàn)鵪鶉胚胎是在雞蛋殼中培養(yǎng)成雛的，以往人們用雞蛋或火雞蛋做代用蛋殼培養(yǎng)雞胚也獲得了成功，表明禽類胚胎和同種[4-5]或不同種[9]禽類蛋殼之間可能不存在排斥反應(yīng)。

3.3 胚胎死因分析

胚胎死亡出現(xiàn)兩次高峰，第一次高峰出現(xiàn)在2.5 d換殼及隨后較短的一段時(shí)間，7例中4例可能是由于卵黃沒有了自然狀態(tài)下系帶的固定，在代用蛋殼中偏離正常位置，與蛋殼發(fā)生粘連而造成換殼時(shí)卵黃破裂。隨即損失的3例可能與換殼的機(jī)械性刺激有關(guān)。第二次高峰出現(xiàn)在落盤后，從25例胚胎死亡的時(shí)間上分析，應(yīng)該是多種因素持續(xù)作用累積的結(jié)果，在重新構(gòu)建的鵪鶉胚胎培養(yǎng)體系中，雞蛋殼的大小、形狀及其礦物質(zhì)的種類、含量和比例，雞稀蛋白的成分，蛋殼內(nèi)容物表面無內(nèi)殼膜，兩次換殼的機(jī)械性刺激，氣室的大小，封口保鮮膜的通透性，翻蛋角度等都有別于正常孵化，這些因素都有可能潛移默化地對(duì)鵪鶉胚胎的正常發(fā)育產(chǎn)生著不同程度的影響，隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移，這些影響逐漸積累，最終在末期以大量胚胎死亡的形式表達(dá)出來。正常孵化條件下，翻蛋角度為90°，翻蛋有利于孵化初期卵黃囊的擴(kuò)大和血管的分布，使卵黃迅速被胚胎利用而減輕，在孵化末期剩余的卵黃隨著卵黃囊的收縮一同進(jìn)入腹腔；翻蛋可促進(jìn)尿囊絨毛膜的擴(kuò)展，使形成的蛋白囊與卵黃囊和羊膜腔保持正常的相對(duì)位置，保證蛋白順利地通過漿羊膜道進(jìn)入羊膜腔而被胚胎利用；翻蛋還能防止胚胎和胎膜與殼膜粘連[10-11]?？梢姺安灰?guī)范，一旦出現(xiàn)胎膜粘連，將導(dǎo)致卵黃不能進(jìn)入腹腔、尿囊絨毛膜無法合圍以及漿羊膜道阻塞蛋白吸收不完全。本試驗(yàn)為避免代用蛋殼開口對(duì)胎膜的損傷，2.5～14 d翻蛋角度設(shè)為50°，后期死亡胚胎尿囊絨毛膜不完整，代用蛋殼銳端有少量蛋白殘存，卵黃未完全進(jìn)入腹腔，表明在造成胚胎死亡的諸多因素中，翻蛋角度小是罪魁禍?zhǔn)?。另外胚胎在超常?guī)的人為環(huán)境下培養(yǎng)出現(xiàn)弱雛和畸形雛也不足為怪。

4 結(jié) 論

鵪鶉胚胎與雞稀蛋白及蛋殼之間不存在排斥反應(yīng)，用雞稀蛋白和蛋殼培養(yǎng)鵪鶉胚胎是可行的。

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