亞硝酸鹽氧化菌(NOB)的富集培養(yǎng)與其污泥特性分析

董怡君,王淑瑩,汪傳新,張宇坤,彭永臻 (北京工業(yè)大學(xué),北京市水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京市污水脫氮除磷處理與過(guò)程控制工程技術(shù)研究中心,北京 100124)

短程硝化即實(shí)現(xiàn)AOB的富集以及NOB的抑制和淘洗,為當(dāng)前脫氮領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[1-3].通過(guò)調(diào)控溫度、pH值、DO、FA、FNA、HRT等影響因素,可實(shí)現(xiàn)短程[4-7].因此,有必要對(duì)AOB和NOB分別富集培養(yǎng)以深入了解其種群性質(zhì)以及動(dòng)力學(xué)參數(shù).于莉芳等[8]用富含高氨氮的污泥水富集AOB和NOB,FISH分析結(jié)果顯示AOB占全菌總數(shù)的15.7%±3.7%,NOB占全菌總數(shù)的12.9%±3.2%;Chen等[9]用Membrane-Coupled Bioreactors(MBRs)工藝富集硝化細(xì)菌,FISH分析結(jié)果顯示Nitrosomonas(AOB的一個(gè)種,菌體呈桿狀或橢球狀)占全菌總數(shù)的60%,不含Nitrobacter; Vadivelu等[10-13]用SBR富集NOB,FISH分析結(jié)果顯示Nitrobacter占全菌總數(shù)73%.上述文獻(xiàn)中多側(cè)重研究全程硝化(AOB與NOB同時(shí)富集),或研究短程硝化(富集 AOB),由于其 NOB富集程度不高,不利于對(duì) NOB動(dòng)力學(xué)參數(shù)的研究.本驗(yàn)側(cè)重富集NOB,并研究其特性,為準(zhǔn)確測(cè)定NOB動(dòng)力學(xué)參數(shù)打好基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置及運(yùn)行方式

采用小試 SBR來(lái)富集 NOB,反應(yīng)器容積為12L,其有效容積為 8L,反應(yīng)器密封.裝置每天運(yùn)行4個(gè)周期,每個(gè)周期時(shí)間為6h,其中進(jìn)水10min,曝氣并攪拌5h,沉淀40min,排水10min.每次進(jìn)水2L,水力停留時(shí)間為20h,溫度控制在(25±1); ℃曝氣量恒定為 0.12m3/h,溶解氧變化范圍為 5.4～8.4mg/L;攪拌轉(zhuǎn)速為 185r/min; pH 值在 7.2～7.7之間.

1.2 試驗(yàn)用水及接種污泥

采用配水富集 NOB,原水為去離子水,以減少其他細(xì)菌或雜物進(jìn)入系統(tǒng).以NaNO2作為唯一的能源,其進(jìn)水濃度范圍為 150～1000mg/L.每升配水中,其他成分如下[10]:0.4g NaHCO3,1g KH2PO4,1.31g K2HPO4以及2mL的微量元素溶液.每升水中微量元素成分為[11]:1.25g EDTA,0.55g ZnSO4·7H2O,0.4g CoCl2·6H2O,1.275g MnCl2·4H2O,0.4g CuSO4·4H2O,0.05g Na2MoO4·2H2O,1.375g CaCl2·2H2O,1.25g FeCl3·6H2O,44.4g MgSO4·7H2O.接種污泥取自處理某大學(xué)居民區(qū)生活污水的中試 SBR,其污泥具有正常的硝化功能.

1.3 試驗(yàn)方案

試驗(yàn)共運(yùn)行 65d,根據(jù)不同的運(yùn)行狀況可分為 2個(gè)階段:第 1階段(0～38d),為提升負(fù)荷階段,進(jìn)水亞硝酸鹽氮濃度為 150～800mg/L,在反應(yīng)周期末系統(tǒng)中的亞硝酸鹽氮濃度小于0.2mg/L時(shí)提升進(jìn)水濃度,即提升負(fù)荷,提高NOB的富集程度;第 2階段(39～65d),為穩(wěn)定運(yùn)行階段,進(jìn)水亞硝酸鹽氮濃度為800～1000mg/L.

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及分析方法

溫度、pH值和ρ(DO)采用德國(guó)WTW Multi 340i及相應(yīng)傳感器在線檢測(cè). ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)、ρ(MLSS)、ρ(MLVSS)等指標(biāo)均采用國(guó)家規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定[14];污泥的沉降速度、含水率、平均粒徑等指標(biāo)根據(jù)Beun等[15]的方法測(cè)定;采用Olympus-BX61型顯微鏡,對(duì)污泥形態(tài)及微生物相進(jìn)行觀測(cè),并通過(guò) FISH技術(shù)對(duì)NOB進(jìn)行定性及半定量分析;經(jīng)預(yù)處理后,采用FEIQuanta 200型掃描電鏡觀察污泥的微觀結(jié)構(gòu).

表1 試驗(yàn)過(guò)程中FISH分析所用的探針序列、雜交緩沖液濃度及目標(biāo)菌Table 1 FISH probes used, their target groups and hybridization conditions in this study

按照Amann等[16]的操作方法進(jìn)行FISH分析.采用4%PFA,4℃條件下對(duì)污泥樣品固定2～3h.對(duì)固定后的污泥樣品超聲分散1min,將樣品滴加在明膠包被過(guò)的載玻片上,空氣中干燥后先后浸泡于50%、80%和98%的乙醇溶液中脫水3min.雜交緩沖液組成包括0.9mol/L NaCl、20mmol/L Tris/HCl,0.01% SDS和甲酰胺,pH值為7.2.將熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針溶解于雜交緩沖液中,在46℃下與污泥樣品雜交 2h.雜交結(jié)束后,采用洗脫緩沖液在48 ℃下洗脫20min.在干燥后的樣品上滴加抗熒光衰減液,對(duì)每個(gè)污泥樣品隨機(jī)拍攝20～25張照片(OlympusBX61熒光顯微鏡)用于定量分析.FISH分析所使用的探針序列、緩沖液濃度及目標(biāo)菌見(jiàn)表1.

2 結(jié)果與討論

2.1 各階段進(jìn)出水水質(zhì)變化

由圖 1可以看出,亞硝酸鹽氮出水濃度初始時(shí)為32mg/L,在第4d降低到0.2mg/L以下并逐漸平穩(wěn),相應(yīng)的其去除率也由 53.6%升高并逐漸趨近于 100%,直至富集 65d,亞硝酸鹽氮出水濃度一直在 0.2mg/L以下,相應(yīng)的去除率也一直接近于100%.

圖1 富集過(guò)程中混合后NO2--N濃度、出水NO2--N濃度及其去除率變化情況Fig.1 Variations of initially mixed NO2--N concentration,effluent NO2--N concentration and removal rate of NO2--N during the experimental period

圖2 原水NO2--N濃度及比硝化速率變化情況Fig.2 Variations of NO2--N concentration of raw wastewater and specific nitrification rate

如圖 2所示,原水亞硝酸鹽氮的濃度由150mg/L逐漸增加至1000mg/L.在富集過(guò)程中,污泥中的NOB經(jīng)過(guò)4d的培養(yǎng)逐漸適應(yīng)了生長(zhǎng)環(huán)境的變化,反應(yīng)時(shí)間內(nèi)可以完全氧化所添加的亞硝酸鹽,因此提高負(fù)荷.進(jìn)水亞硝酸鹽氮的濃度由150mg/L逐漸增加至800mg/L時(shí),NOB的富集程度逐漸升高,因此其比硝化速率持續(xù)增加,最大值為 131.03mg/(g MLVSS·h);而由 800mg/L 增加到1000mg/L時(shí),比硝化速率開(kāi)始降低.在穩(wěn)定運(yùn)行20d后,比硝化速率開(kāi)始增加并恢復(fù).這是因?yàn)?原水亞硝酸鹽氮濃度為 1000mg/L時(shí),進(jìn)水混合后FNA濃度為0.0364mg HNO2-N/L,此濃度的FNA抑制了亞硝酸鹽的氧化,可能也會(huì)抑制 NOB的生長(zhǎng);而當(dāng)維持進(jìn)水亞硝酸鹽氮濃度為1000mg/L一段時(shí)間后,比硝化速率又有恢復(fù),說(shuō)明NOB可以適應(yīng)此濃度的FNA.

圖3 第40d第2周期的NOx濃度、pH值及DO的變化情況Fig.3 Variations of NOx concentration, pH and DO at the second cycle of 40th day

污染物濃度每小時(shí)取樣1次,pH值及DO間隔5min讀數(shù)1次(圖3).為方便分析,將亞硝酸鹽降解完成的點(diǎn)稱為亞硝酸鹽拐點(diǎn)(NBP).在此周期內(nèi),亞硝酸鹽氮濃度值與時(shí)間的線性關(guān)系方程為 Y=-1.131X+199.2(R2=0.999),可看出亞硝酸鹽降解曲線線性程度很高,說(shuō)明此反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng),亞硝酸鹽降解過(guò)程中一直以最大速率 umax進(jìn)行.由圖3可以看出,pH值在整個(gè)反應(yīng)周期內(nèi)基本沒(méi)有變化,維持在 7.5左右,這是由于在反應(yīng)體系中有HCO3-存在,對(duì)pH的變化有緩沖作用,因此,反應(yīng)過(guò)程中的 pH值基本不變.亞硝酸鹽氧化過(guò)程中,DO基本保持平衡,這是由于亞硝酸鹽氧化速率的小幅度變化導(dǎo)致耗氧速率變化程度較小,而供氧速率不變,因而會(huì)引起DO小幅度的變化;而當(dāng)出現(xiàn) NBP點(diǎn)時(shí),DO會(huì)有大幅度的上升,直至DO達(dá)到最大值后保持不變.

2.2 富集前后的菌群結(jié)構(gòu)變化情況

經(jīng)過(guò) 65d的富集培養(yǎng),污泥濃度約為700mg/L.FISH 分析結(jié)果顯示(圖 4),接種污泥中Nitrospira占全菌總數(shù)的0.01%,Nitrobacter約占全菌總數(shù)的0.01%;而在培養(yǎng)65d后, Nitrospira約占全菌總數(shù)的5%,Nitrobacter約占全菌總數(shù)的80%.由此可見(jiàn),NOB菌在活性污泥中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì).

圖4 接種污泥及培養(yǎng)65d后系統(tǒng)中活性污泥FISH分析Fig.4 The FISH analysis of inoculum and activated sludge after 65d for the cultivation

圖5 接種污泥和富集成功后污泥的光學(xué)顯微鏡照片F(xiàn)ig.5 Phase contrast microscopy picture of inoculums and sludge after enrichment

本試驗(yàn)富集NOB的優(yōu)勢(shì)菌種為Nitrobacter,主要原因可能是進(jìn)水亞硝酸鹽氮濃度(1000mg/L)比較高,FNA濃度(0.0364mg HNO2-N/L)比較高,反應(yīng)過(guò)程 DO 濃度(5.4～8.4mg/L)較高,這樣的條件較適合Nitrobacter的生長(zhǎng).而Vadivelu等[12]采用緩慢進(jìn)水的方式,控制較高 DO 濃度(2.75～3.25mg/L),持續(xù)進(jìn)水270min,運(yùn)行12個(gè)月也富集出 Nitrobacter占全菌總數(shù) 73%的活性污泥;Blackburne等[17]采用每 2h一次的脈沖式進(jìn)水,控制混合后亞硝酸鹽氮濃度小于 100mg/L,成功富集出以Nitrospira為優(yōu)勢(shì)菌種的活性污泥.

2.3 富集前后的污泥性質(zhì)變化情況及成因分析

富集前后污泥形態(tài)特征存在差異.由圖 5所示,接種污泥結(jié)構(gòu)比較松散,形態(tài)不規(guī)則;富集后污泥形成大小不同的橢圓形污泥,排列整齊,形態(tài)規(guī)則.由圖 6所示,富集成功后的污泥呈橢圓形,表面光滑,邊界清晰.由表1可看出,富集前后污泥含水率由99.5%降低到72.5%,MLVSS/MLSS由0.879降到了0.278,SVI降低到了6mL/g左右.上述數(shù)據(jù)表明,SBR系統(tǒng)中的污泥已由絮體污泥轉(zhuǎn)化為顆粒污泥.污泥含水率較低,可簡(jiǎn)化污泥后處理工序.富集后污泥比耗氧速率為 169.3高于接種污泥,這是因?yàn)镹OB的富集程度比較高.

圖6 富集成功后污泥的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.6 Scanning electron microscopy picture of sludge after enrichment

“晶核假說(shuō)”原理認(rèn)為,顆粒污泥的形成類似于結(jié)晶過(guò)程,在晶核的基礎(chǔ)上,顆粒污泥不斷發(fā)育,最終形成了成熟的顆粒污泥;而晶核一般來(lái)源于接種污泥或反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中產(chǎn)生的無(wú)機(jī)鹽沉淀或惰性有機(jī)物[18].由表 2得知,富集前后污泥MLVSS/MLSS降到 0.278,且 SVI為 6,這說(shuō)明污泥無(wú)機(jī)質(zhì)含量很高,而在測(cè)污泥濃度時(shí)已用不少于250mL的去離子水洗泥,說(shuō)明污泥中所含的無(wú)機(jī)質(zhì)均為沉淀物.富集試驗(yàn)用水中含有 Ca2+、Mg2+、Fe3+等金屬離子以及 HCO3-、HPO42-、等陰離子,且 pH 值維持在 7.2～7.7之間,此時(shí),金屬離子易與CO32-、HPO42-等陰離子形成沉淀物[19-20].根據(jù)“晶核假說(shuō)”,這些沉淀物可作為晶核,在其基礎(chǔ)上形成顆粒污泥.因此,本試驗(yàn)形成顆粒污泥的主要原因是絮體污泥以無(wú)機(jī)沉淀物為晶核形成顆粒污泥,而試驗(yàn)采取較長(zhǎng)的沉淀時(shí)間以及不排泥的運(yùn)行方式促進(jìn)了該過(guò)程的進(jìn)行.本試驗(yàn)這種運(yùn)行方式與傳統(tǒng)培養(yǎng)顆粒污泥的方式(逐漸縮短沉淀時(shí)間,促進(jìn) EPS形成等)并不相同,這種方式更有利于將形成的晶核盡可能多的保留在系統(tǒng)中,比較適用于培養(yǎng)長(zhǎng)污泥齡的顆粒污泥.

表2 接種污泥和富集后污泥的特性Table 2 Characteristics of inoculum and sludge after enrichment

3 結(jié)論

3.1 在 SBR中采用恒定曝氣量的方式,以亞硝酸鹽為唯一能源,逐步提高進(jìn)水亞硝酸鹽濃度可實(shí)現(xiàn) NOB的快速富集.經(jīng)過(guò) 65d的富集培養(yǎng),NOB成為優(yōu)勢(shì)菌種,經(jīng) FISH分析顯示Nitrobacter占全菌總數(shù)的80%.

3.2 富集過(guò)程中發(fā)現(xiàn),當(dāng)混合液 FNA濃度達(dá)到0.0364mg HNO2--N/L時(shí)可能會(huì)對(duì)亞硝酸鹽氧化過(guò)程有抑制作用,而經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的適應(yīng),硝化能力能夠恢復(fù).

3.3 富集成功后,SBR中的污泥已由絮狀污泥轉(zhuǎn)變形成顆粒污泥.與富集前污泥相比,SVI有明顯的降低.本試驗(yàn)較長(zhǎng)的沉淀時(shí)間以及不排泥的運(yùn)行方式是該硝化顆粒污泥形成的重要原因.

[1]李澤兵,李 軍,李 妍,等.短程硝化反硝化技術(shù)研究進(jìn)展 [J].給水排水, 2011,37(9):163-168.

[2]李凌云,彭永臻,楊 慶,等.SBR工藝短程硝化快速啟動(dòng)條件的優(yōu)化 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2009,29(3):312-317.

[3]Yuan Z G, Blackall L L. Sludge population optimisation: a new dimension for the control of biological wastewater treatment systems [J]. Water Research, 2002,36(2):482-490.

[4]謝新立,王 欣.短程硝化反硝化生物脫氮的影響因素分析 [J].工業(yè)用水與廢水, 2011,42(2):11-13.

[5]王淑瑩,李 論,李凌云,等.快速啟動(dòng)短程硝化過(guò)程起始pH值對(duì)亞硝酸鹽積累的影響 [J]. 北京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2011,37(7):1067-1072.

[6]Gu S B, Wang S Y, Yang Q, et al. Start up partial nitrification at low temperature with a real-time control strategy based on blower frequency and pH [J]. Bioresource Technology, 2012,112(1):34-41.

[7]Yang Q, Peng Y Z, Liu X H, et al. Nitrogen removal via nitrite from municipal wastewater at low temperatures using real-time control to optimize nitrifying communities [J]. Environmental Science and Technology, 2007,41(23):8159-8164.

[8]于莉芳,陳青青,楊 晉,等.污泥水富集硝化菌的群落結(jié)構(gòu)及動(dòng)力學(xué)參數(shù)研究 [J]. 環(huán)境科學(xué), 2009,30(7):2035-2039.

[9]Chen R D, Lapara T M. Enrichment of dense nitrifying bacterial communities in membrane-coupled bioreactors [J]. Process Biochemistry, 2008,43(1):33-41.

[10]Vadivelu V M, Yuan Z G, Fux C, et al. The inhibitory effects of free nitrous acid on the energy generation and growth processes of an enriched Nitrobacter culture [J]. Environmental Science and Technology, 2006,40(14):4442-4448.

[11]Vadivelu V M, Yuan Z G, Fux C, et al. Stoichiometric and kinetic characterisation of Nitrobacter in mixed culture by decoupling the growth and energy generation processes [J]. Biotechnology and Bioengineering, 2006,94(6):1176-1188.

[12]Vadivelu V M, Keller J, Yuan Z G, et al. Free ammonia and free nitrous acid inhibition on the anabolic and catabolic processes of Nitrosomonas and Nitrobacter [J]. Water Science and Technology, 2007,56(7):89-97.

[13]Vadivelu V M, Keller J, Yuan Z G, et al. Effect of free ammonia on the respiration and growth processes of an enriched Nitrobacter culture [J]. Water Research, 2007,41(4):826-834.

[14]國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局.水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法 [M]. 北京:中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社, 2002:252-354.

[15]Beun J J, van Loosdrecht M C M, Heijnen J J. Aerobic granulation [J]. Water Science and Technology, 2000,41(4-5):41-48.

[16]Amann R I, Krumholz L, Stahl D A. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic, and environmental-studies in microbiology [J]. Journal of Bacteriology, 1990,172(2):762-770.

[17]Blackburne R, Vadivelu V M, Yuan Z G, et al. Kinetic characterisation of an enriched Nitrospira culture with comparison to Nitrobacter [J]. Water Research, 2007,41(14):3033-3042.

[18]崔成武,紀(jì)樹(shù)蘭,高景峰,等.好氧顆粒污泥的形成機(jī)理 [J]. 水處理技術(shù), 2006,32(2):13-15.

[19]吳昌永.A2/O工藝脫氮除磷及其優(yōu)化控制的研究 [D]. 哈爾濱:哈爾濱工業(yè)大學(xué), 2010.

[20]張宇坤,郭亞萍,李 軍,等.序批式顆粒污泥系統(tǒng)中磷的變化和去向分析 [J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2010,30(9):1811-1817.