熊膽粉減少腦缺血損傷大鼠缺血半暗帶皮層神經(jīng)細胞凋亡的機制

富 蘇，韓經(jīng)丹，周 杰，范吉平△

(1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京 100700;2.中國中醫(yī)科學院，北京 100700;3.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102)

近幾年，在各種腦缺血模型中均可看到神經(jīng)元壞死伴有凋亡發(fā)生，并認為凋亡是缺血性神經(jīng)元死亡的一種形式。細胞凋亡成為腦缺血損傷中的研究熱點，并成為開發(fā)治療藥物的治療靶點。熊膽粉味苦性寒，歸肝、膽、心、胃經(jīng)，功用清熱解毒。導師范吉平教授依據(jù)多年中風病治療的臨床經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，熊膽粉對腦缺血損傷具有良好的保護作用。我們課題組之前的研究也已證實，熊膽粉可促進腦缺血損傷大鼠神經(jīng)功能障礙的恢復，減輕神經(jīng)元病理損害，減少細胞凋亡水平。本研究將試圖在上述研究的基礎上進一步揭示熊膽粉減少腦缺血損傷大鼠缺血半暗帶皮層神經(jīng)細胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級SD雄性健康成年大鼠，體質(zhì)量320～350g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司(許可證號SCXK(京)2006-0009)。

1.2 藥物

熊膽粉由山東沃華醫(yī)藥科技股份有限公司提供。陽性對照藥物尼莫地平(商品名尼膜同)購于拜耳醫(yī)藥(國藥準字H20003010，生產(chǎn)批號BJ03850)。

1.3 主要儀器和試劑

恒溫手術臺(SHOR-LINE);MCAO線栓(沙東線栓);電子分析天平(Sartorius);Narrow-Alley Corner Test實驗儀器(北京寬街醫(yī)院);石蠟包埋機(Leica，EG1150H);石蠟切片機(Leica，RM2255);正置顯微鏡(Olympus BX51);光學照像生物顯微鏡(Leica，DMLB-HC);圖像采集系統(tǒng)(Leica DM4000B);圖像分析系統(tǒng)(Image-pro Plus 5.0)。

水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司);0.9%生理鹽水(石家莊四藥);4%多聚甲醛(SUNBIO);超純水(中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗中心機能實驗室);乙醇、二甲苯、鹽酸酒精、兔抗大鼠Bax、Bcl-2、CytC、Caspase-9、Caspase-3 免疫組化試劑盒(武漢博士德)。

1.4 造模方法

大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.35 mL·100 g－1)，大鼠麻醉成功后仰臥位固定，頸部正中切口，分離并暴露右側頸總動脈及頸內(nèi)、外動脈，頸總動脈近心端和頸內(nèi)動脈搭一根尼龍線系活扣，頸外動脈近心端和遠心端分別用一根尼龍線結扎，2根結扎尼龍線之間間距0.5 cm。頸總動脈動脈夾夾閉后，在頸外動脈上兩根結扎的尼龍線之間剪短，后將頸外動脈近心端下翻，與境內(nèi)動脈成一天直線，從頸外動脈剪一個小口插入線栓，插入長度約為(20.0±0.5)mm時感到有輕微阻力時停止，在頸內(nèi)動脈處扎緊尼龍線并固定線栓，扎緊頸總動脈近心端尼龍線，取下動脈夾，縫合皮膚。術后常規(guī)護理。待實驗動物清醒后進行Zea-Longa神經(jīng)功能評分，神經(jīng)功能評分標準為:①無神經(jīng)功能損傷癥狀，動物正常活動，進食評0分;②將動物尾巴提起后，左前肢屈曲1分;③將動物放置平板上向左側轉圈2分;④將動物放置平板上，用手輕推向左側傾倒3分;⑤動物左側偏癱，不能自發(fā)行走意識朦朧或喪失4分。評分大于或等于2分，則表明模型成功，低于2分則予以去除。

1.5 分組與給藥

造模成功的實驗動物，根據(jù)神經(jīng)功能評分分層隨機分為五組，分別為正常對照組(蒸餾水)、假手術組(蒸餾水)、模型組(蒸餾水)、尼莫地平組(尼莫地平研碎蒸餾水溶解，按照臨床用量人大鼠體表面折算給藥劑量為 32.4 mg·kg－1，配制成藥物濃度為3.24 mg·mL－1的蒸餾水溶液)、熊膽粉組(通絡化痰膠囊蒸餾水溶解，按照臨床用量人大鼠體表面折算給藥劑量為27 mg·kg－1，配制成藥物濃度為2.7 mg·mL－1的蒸餾水溶液)。從術后第1天開始給藥，以1 mL·100 g－1體質(zhì)量體積灌胃給藥，每天1次，連續(xù)灌胃給藥7d。

1.6 取材及標本制作

術后第8天每組隨機取6只，10%水合氯醛深度麻醉(0.35 mL·100 g－1)，迅速打開胸腔，暴露心臟，剪開右心房，于心尖部剪開左心室，插管至主動脈，快速注入100 ml生理鹽水沖洗后，再以體積分數(shù)為4%的多聚甲醛(PH值調(diào)成7.0左右)灌注固定后斷頭取腦。取得的腦組織入4℃4%多聚甲醛固定液中固定過夜，經(jīng)過固定、脫水、透明、石蠟包埋處理，連續(xù)冠狀切片，切片厚度為5 μm。

1.7 免疫組織化學測 Bax、Bcl-2、CytC、Caspase-9、Caspase-3表達的變化

組織切片，常規(guī)脫蠟，抗原修復后用0.3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，37℃孵育5 min三遍，滴加一抗;37℃孵育2 h，滴加二抗;37℃孵育30 min，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液;37℃孵育50 min，DAB顯色、復染、脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察。首先在40倍光鏡下定位缺血側缺血半暗帶額頂葉皮層，每組6只，每只動物取5張相同部位腦片，后在400倍光鏡下選取5個相鄰視野對陽性神經(jīng)元(胞漿呈棕黃色顆粒)進行觀察，采用Image-pro Plus 5.0軟件測定陽性細胞的光密度值。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 熊膽粉對pMCAO大鼠缺血半暗帶皮層細胞CytC、Caspase-9、Caspase-3表達的影響

表1圖1～圖3顯示，正常對照組和假手術組CytC、Caspase-9和Caspase-3陽性細胞表達不明顯，模型組可見CytC、Caspase-9和Caspase-3陽性細胞表達增多，與正常對照組和假手術組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，表現(xiàn)為細胞胞漿呈棕黃色，甚至胞核濃染呈棕褐色，有顆?；驂K狀沉淀。與模型組比較，熊膽粉及尼莫地平給藥干預后其 CytC、Caspase-9和Caspase-3陽性表達減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01，P ＜0.05)。

Table 1 Effect of Bear bile power on the expression of CytC，Caspase-9 and Caspase-3 of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(－x ± s)

Fig 1 Effect of Bear Bile Power on the expression of CytC of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(Immunohistochemical staining×400)

2.2 熊膽粉對pMCAO大鼠缺血半暗帶皮層Bax、Bcl-2免疫組化結果的影響

Fig 2 Effect of Bear Bile Power on the expression of Caspase-9 of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(Immunohistochemical staining×400)

Fig 3 Effect of Bear Bile Power on the expression of Caspase-3 of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(Immunohistochemical staining×400)

表2圖4、5顯示，正常對照組和假手術組可見Bcl-2陽性細胞表達，表現(xiàn)為細胞胞漿濃染呈棕褐色，有顆?；驂K狀沉淀;熊膽粉組及尼莫地平給藥干預后可見的Bcl-2陽性表達增多，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。正常對照組和假手術組Bax陽性細胞表達不明顯，模型組可見Bax陽性細胞表達增多，表現(xiàn)為細胞胞漿呈棕黃色，甚至胞核濃染呈棕褐色，成團塊狀;與模型組比較，熊膽粉組及尼莫地平給藥干預后其Bax蛋白減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，P＜0.05)。

Table 2 Effect of Bear bile power on the expression of Bax and Bcl-2 of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(±s)

Table 2 Effect of Bear bile power on the expression of Bax and Bcl-2 of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(±s)

注:＊＊ P ＜0.01 vs Model Group;*P ＜0.05 vs Model Group;##P ＜0.01 vs Sham Group;#P ＜0.05 vs Sham Group

Group n Bax(IOD)Bcl-2(IOD)Normal 6 56.91 ±6.03 45.67 ±8.04 Sham 6 54.87 ±5.68 47.33 ±7.67 Model 6 98.70 ±7.83## 71.44 ±5.45##Nimodipine 6 66.93 ±6.74＊＊ 97.52 ±6.05＊＊BBP 6 72.57 ±5.74＊＊ 86.38 ±6.72＊＊

Fig 4 Effect of Bear Bile Power on the expression of Bax of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(Immunohistochemical staining×400)

3 討論

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡(programed cell death，PCD)，是由基因控制的細胞自主的有序的死亡。MacManuS等在1993年首次報道大鼠全腦缺血與神經(jīng)細胞凋亡的關系，至此之后神經(jīng)細胞凋亡在腦缺血損傷中的作用日益受到關注。研究表明，神經(jīng)細胞凋亡是腦缺血損傷病理作用的重要環(huán)節(jié)，是造成腦缺血損傷后繼發(fā)性損害的重要機制［1，2］。腦缺血損傷既可造成細胞壞死，又可誘導細胞凋亡。細胞壞死是一個不可逆的過程，而細胞凋亡則是受一系列程序調(diào)控的過程，在腦缺血損傷后及早進行抗凋亡治療具有重要意義［3］。

Fig 5 Effect of Bear Bile Power on the expression of B Bcl-2of neurons in ischemic penumbra of rats with pMCAO(Immunohistochemical staining×400)

細胞凋亡中最經(jīng)典的途徑之一為線粒體途徑(內(nèi)途徑)。線粒體對于多細胞生物至關重要。沒有線粒體細胞會停止有氧呼吸并迅速死亡，這一機制也是很多凋亡通路的關鍵。凋亡蛋白通過不同的方式以線粒體為靶點破壞線粒體的作用，通過線粒體膜孔道的形成導致線粒體腫脹，或者通過提高線粒體膜的通透性導致凋亡效應器的漏出［4］。線粒體直接或間接地形成特定的孔道來釋放凋亡因子，如細胞色素C。在細胞質(zhì)內(nèi)，細胞色素C與Apaf-1聚合，吸引caspase-9前體形成凋亡(apoptosome)。這導致caspase-9的分裂和激活，caspase-9同時可以反過來分裂和激活下游的caspase-3，后者起到細胞凋亡過程效應器的作用。研究表明［5～7］，在caspase家族中，caspase-3是caspase級聯(lián)“瀑布”下游最關鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，它在正常細胞中是以酶原形式存在，受凋亡刺激因素作用后激活，活化的caspase-3可以激活核因子、細胞骨架蛋白及DNA修復酶等，引起細胞形態(tài)的變化，如出現(xiàn)細胞皺縮、DNA裂解、染色體濃縮和凋亡小體的形成等，最終導致細胞凋亡，caspase-3在各種因素啟動的凋亡程序中起最后的樞紐作用。通過抑制caspase-3的活化，可以產(chǎn)生對缺血性腦損傷的保護作用［8～10］。Bcl-2家族基因是腦缺血神經(jīng)元凋亡調(diào)控基因的重要組成部分。Bcl-2蛋白家族包括Bcl-2樣促生存亞家族(Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等)和Bcl-2樣促凋亡亞家族(Bax、Bak、Bcl-xS等)2種。目前研究較多的是Bax和Bcl-2蛋白，Bcl-2增高，抑制神經(jīng)細胞凋亡;Bax增高，促進神經(jīng)細胞凋亡［11］，研究已發(fā)現(xiàn)Bax和Bcl-2將直接進入到細胞凋亡的線粒體途徑(內(nèi)途徑)中參與調(diào)節(jié)細胞凋亡的過程。

熊膽粉味苦性寒，歸肝、膽、心、胃經(jīng)，功用清熱解毒，課題組既往臨床試驗也證實，以熊膽粉為君藥的通絡化痰膠囊可減少腦梗死病人的神經(jīng)功能缺損癥狀［12］。腦缺血損傷后的級聯(lián)反應所形成的一系列神經(jīng)生化毒素，導致神經(jīng)功能損害，當屬中醫(yī)學痰、瘀、毒邪范疇，亦為應用中藥抑制或阻斷缺血后級聯(lián)反應成為中醫(yī)藥治療中風病的特色機制。本研究揭示腦缺血損傷后早期應用熊膽粉可以調(diào)節(jié)腦缺血損傷后神經(jīng)細胞凋亡線粒體途徑中關鍵蛋白CytC、Caspase-3和Caspase-9的表達，并且可調(diào)節(jié)參與調(diào)節(jié)腦缺血損傷神經(jīng)細胞凋亡線粒體途徑中的Bcl-2基因家族成員Bcl-2和Bax，這可能是熊膽粉促進腦缺血損傷大鼠損傷后神經(jīng)功能障礙的恢復、減輕神經(jīng)元病理損害、減少細胞凋亡水平的分子機制之一。

［1］WANGP，WANGW，XUYL，et al.Comparison of focal cerebra1 ischemia-reperfusion induced apoptosis of astrocytes and neurons in rats［J］.Chin J Histoehem Cytochem，2006，16(2):113-118.

［2］Morphological Characteristic of apoptosis and its significance in neurogenesis［J］.J Morfologiia，2007，131(2):16-28.

［3］DouglasR G，Guido K.Pharmacological manipulation of cell death:clinical applications in sight［J］.J Clin In vest，2005，115:2610-2617.

［4］Cotran，Kumar，Collins(1998).Robbins Pathologic Basis of Disease.Philadelphia:W.B Saunders Company.

［5］John C R.Mechanisms of apoptosis［J］.Am J Path，2000，157(5):1415-1430.

［6］Cohen G M.Caspase:The executioners of apoptosis［J］.Biochem J，1997，326:1-16.

［7］Earnshaw W C，M artins L M，Kaufmann S H.Mammalian caspases:structure，activation，substrates and functions during apoptosis［J］.Annu Rev Biochem，1999，68:383-424.

［8］Reed J C.Apoptosis-based therapies［J］.Nat Rev Drug Discov，2002，1(2):111-121.

［9］Cheng Y，Deshmukh M，D’Costa A，et al.Caspase inhibitor affords neuroprotection with delayed administration in a rat model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury［J］.J Clin Invest，1998，101(9):1992-1999.

［10］Inna N L，Alexander G，Peter H K.Caspase:pharmacological manipulation of cell death［J］.J Clin Invest，2005，115(10):2665-2672.

［11］CHRYSIS D，CALIKOGLU AS，YEP，et al.Insulin-like growth factor-1 over expression at tenuates cerebral apoptosis by altering the expression of Bcl family protein in a developmentally specific manner［J］.J Neurosci，2001，21(3):1481-1490.

［12］馬大勇，韓振蘊，范吉平，等.通絡化痰膠囊治療腦梗死恢復期痰瘀阻絡353例臨床研究［J］.中醫(yī)雜志，2012，53(7):563-567.