脾氣虛型HIV/AIDS患者淋巴細(xì)胞線粒體功能狀態(tài)在常溫和熱應(yīng)激條件下的改變情況＊

孫 萌，劉 穎，王克林，徐淑玲，孫 剛，王笑紅，翟志光，楊鳳珍，王 健△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院艾滋病防治研究中心，北京 100700)

近來(lái)大量研究表明，HIV病毒、炎性細(xì)胞因子以及高效抗病毒治療藥物等都會(huì)對(duì)HIV/AIDS患者免疫細(xì)胞線粒體功能產(chǎn)生不良影響。線粒體有“細(xì)胞的動(dòng)力站”之稱，這與中醫(yī)脾為“氣血生化之源”、“后天之本”有著密切聯(lián)系。劉友章等認(rèn)為，脾主運(yùn)化更重要的是指食物在線粒體內(nèi)的生物氧化過(guò)程，故其功能正常與否與細(xì)胞線粒體功能的完整有極密切的關(guān)系［1］。王健認(rèn)為HIV/AIDS患者的中醫(yī)證候以復(fù)合證為主，其中脾氣虛證最多見［2］。

因此，本研究比較脾氣虛證HIV/AIDS患者與健康人群淋巴細(xì)胞在37℃和40℃條件(模擬熱應(yīng)激)下，淋巴細(xì)胞線粒體膜電位(代表ATP合成能力，間接反應(yīng)細(xì)胞能量代謝)差異，探討HIV/AIDS患者脾氣虛損病機(jī)的部分細(xì)胞免疫學(xué)基礎(chǔ)，為中醫(yī)藥防治艾滋病提供理論支持和依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 被試資料

健康人群來(lái)自中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院研究生院學(xué)生志愿者，陽(yáng)性被試人群來(lái)自北京市地壇醫(yī)院跟蹤隨訪的北京市HIV/AIDS患者，經(jīng)蛋白印記試驗(yàn)確認(rèn)為HIV抗體陽(yáng)性。HIV/AIDS患者分類按照美國(guó)疾病預(yù)防控制中心修訂的HIV感染分類與CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)分期方法。

1.2 調(diào)研方法

采用預(yù)先制定的“HIV/AIDS患者臨床癥狀調(diào)查表”對(duì)患者進(jìn)行詳細(xì)詢問(wèn)。脾氣虛證候診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局1997年頒布的中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《中醫(yī)臨床診療術(shù)語(yǔ)·證候部分》及《中醫(yī)虛證辨證參考標(biāo)準(zhǔn)》、《艾滋病中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則草案·內(nèi)部參考》、《中醫(yī)診斷學(xué)》等相關(guān)證候診斷標(biāo)準(zhǔn)，按照主證、次證及相應(yīng)的選擇條件進(jìn)行統(tǒng)一辨證。篩選后確定健康被試者10名和脾氣虛證HIV/AIDS患者30名，其中HIV/AIDS患者20名，AIDS患者10名。

1.3 CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

觀察給藥后患者CD4+T淋巴細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)。清晨采靜脈血外周血2ml，將每人份全血按 1ml分為 2管，分別在37℃、40℃ 溫度孵育1h，然后運(yùn)用JC-1熒光染色法，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)淋巴細(xì)胞早期凋亡信號(hào)——細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位［1］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

組間比較用獨(dú)立樣本 t檢驗(yàn)，相關(guān)分析為Pearson積差相關(guān)，P≤0.05為可接受的顯著性水平。

2 結(jié)果

圖1 常溫(37℃孵育1h)及高熱(40℃孵育1h)條件下健康人群和脾氣虛HIV/AIDS患者淋巴細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

圖1顯示，在37℃和40℃條件(模擬發(fā)熱)下，本研究采用線粒體膜電位正常淋巴細(xì)胞占總淋巴細(xì)胞的百分比(流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖中Q2-1區(qū)黑色點(diǎn)代表線粒體膜電位正常淋巴細(xì)胞群)，反映個(gè)體淋巴細(xì)胞線粒體氧化磷酸化狀態(tài)(代表ATP合成能力，間接反應(yīng)細(xì)胞代謝和肌肉乏力指標(biāo))，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康對(duì)照人群和脾氣虛證型HIV/AIDS患者感染者人群之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖2顯示，37℃條件下健康人群(n=10)線粒體膜電位正常淋巴細(xì)胞平均占總淋巴細(xì)胞的92.1±6.5%，40℃條件下健康人群(n=10)線粒體膜電位正常淋巴細(xì)胞平均占總淋巴細(xì)胞的95.8±4.5%。而常溫37℃條件下氣虛證型HIV/AIDS患者(n=30)線粒體膜電位正常淋巴細(xì)胞平均占總淋巴細(xì)胞的57.5±26.9%，40℃條件下氣虛證型HIV/AIDS患者(n=30)線粒體膜電位正常淋巴細(xì)胞平均占總淋巴細(xì)胞的46.8±31.3%。脾氣虛證型HIV/AIDS患者淋巴細(xì)胞線粒體氧化磷酸化狀態(tài)比較健康對(duì)照組人群明顯降低，在一定程度上說(shuō)明免疫淋巴細(xì)胞能量代謝功能的下降是其氣虛證型的本質(zhì)所在。

圖2 常溫(37℃孵育1h)及高熱(40℃孵育1h)不同溫度條件下健康人群和脾氣虛HIV/AIDS患者線粒體膜電位正常淋巴細(xì)胞百分比示意圖

圖3 不同水平CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)HIV/AIDS患者線粒體膜電位正常淋巴細(xì)胞百分比示意圖

圖3顯示，以CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)是否小于每毫升全血350個(gè)為分組標(biāo)準(zhǔn)，將脾氣虛證HIV/AIDS患者分為2組進(jìn)行比較，盡管2組感染者之間的CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但2組淋巴細(xì)胞中線粒體膜電位正常百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò) Pearson積差相關(guān)分析顯示，脾氣虛證HIV/AIDS患者CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)與線粒體膜電位正常淋巴細(xì)胞百分比之間呈正相關(guān)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≥0.05)。

3 討論

從現(xiàn)代應(yīng)激理論解釋慢性消耗性疾病導(dǎo)致人體元?dú)馓摀p的狀態(tài)，其顯著特征就是對(duì)生活中不可預(yù)知的應(yīng)激適應(yīng)能力的下降，如表現(xiàn)淋巴細(xì)胞凋亡易感性增高，在熱應(yīng)激以及氧化應(yīng)激過(guò)程中生存能力下降而大量凋亡等［3］。本研究顯示，健康人群淋巴細(xì)胞在40℃孵育條件下線粒體膜電位有上升趨勢(shì)，說(shuō)明在發(fā)熱情況下健康人淋巴細(xì)胞的能量代謝上升，為應(yīng)激提供能量?jī)?chǔ)備;而HIV/AIDS患者淋巴細(xì)胞在40℃孵育條件下，線粒體功能有下降趨勢(shì)，這也反映了患者在熱應(yīng)激條件下淋巴細(xì)胞能量代謝的下降，不足以應(yīng)對(duì)發(fā)熱情況下免疫激活的能量?jī)?chǔ)備。另?yè)?jù)文獻(xiàn)報(bào)道，HIV/AIDS患者臨床上出現(xiàn)頻次最高的癥狀為發(fā)熱約占80%，其次為乏力約占74%。脾氣虛證HIV/AIDS患者在臨床上最明顯的癥狀之一就是乏力。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康人群比較脾氣虛證HIV/AIDS患者淋巴細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降，特別是在體外模擬熱應(yīng)激條件下(40℃孵育1h)，反映了其機(jī)體在發(fā)熱情況下能量代謝功能的下降，印證了脾氣虛HIV/AIDS患者臨床上出現(xiàn)的發(fā)熱乏力等癥狀。

本研究還比較了不同水平CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)HIV/AIDS患者線粒體膜電位情況，發(fā)現(xiàn)脾氣虛證HIV/AIDS患者CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)與其淋巴細(xì)胞線粒體膜電位之間有一定的相關(guān)性，但相關(guān)性不顯著。這與國(guó)外報(bào)道HIV/AIDS患者CD4+T淋巴細(xì)胞的減少程度與淋巴細(xì)胞線粒體膜電位的降低呈顯著性正相關(guān)有所不同。因?yàn)楸狙芯恐皇窃谝粋€(gè)時(shí)間點(diǎn)橫斷面采集被試人群的資料和數(shù)據(jù)，還需要進(jìn)行長(zhǎng)期縱向跟蹤研究才能得到更加全面的數(shù)據(jù)。

當(dāng)前，改善HIV/AIDS患者免疫系統(tǒng)重建的研究工作已逐漸引起重視，但臨床上評(píng)價(jià)中醫(yī)藥治療HIV/AIDS療效及其免疫系統(tǒng)功能的指標(biāo)仍主要依據(jù)CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)和病毒載量，這存在很大的局限性，是亟待研究解決的問(wèn)題之一。因?yàn)镃D4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)僅代表CD4+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，不能完全反映免疫系統(tǒng)的功能，更不能反映免疫細(xì)胞能量代謝水平;另一方面，病毒載量測(cè)定適用于評(píng)價(jià)HIV感染晚期HAART療法的療效，并不適合評(píng)價(jià)中醫(yī)藥治療HIV/AIDS感染者的療效［4］。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)HIV/AIDS患者的治療思路首先是針對(duì)病原體HIV病毒(如HAART療法可以抑制HIV病毒的復(fù)制)，然而HAART療法盡管能明顯降低血漿病毒載量，但難以清除匿伏在細(xì)胞中的病毒，且對(duì)于無(wú)癥狀HIV感染者長(zhǎng)期進(jìn)行HAART療法會(huì)直接損害其細(xì)胞線粒體功能，出現(xiàn)能量代謝紊亂等副作用。特別是最近幾年研究表明，HIV病毒直接對(duì)CD4+T細(xì)胞的殺傷導(dǎo)致機(jī)體CD4+T細(xì)胞的下降，進(jìn)而誘發(fā)AIDS的致病原理還有待商榷。HIV/AIDS患者免疫激活程度比血漿中病毒載量能夠更好地預(yù)測(cè)疾病的發(fā)展進(jìn)程。而傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)十分重視調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體抵抗疾病的能力。研究發(fā)現(xiàn)，不少中醫(yī)藥能夠改善免疫細(xì)胞的能量代謝以及雙向調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能［5］。因此本研究提出 HIV/AIDS患者脾氣虛損病機(jī)，同時(shí)揭示其脾氣虛病機(jī)的部分細(xì)胞免疫學(xué)基礎(chǔ)，為中醫(yī)藥防治HIV/AIDS提供理論支持和依據(jù)，從而更好地指導(dǎo)中醫(yī)臨床，提高辨證論治療效。

［1］侯麗穎，劉友章，賀松其，等.中醫(yī)脾與線粒休功能的相關(guān)性探討［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2008，42(7):3-4.

［2］楊鳳珍，劉穎，李洪娟，等.HIV/AIDS中醫(yī)病因病機(jī)及證治規(guī)律研究進(jìn)展［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2004，11(4):365-367.

［3］王瑋文，邵楓，劉美，等.慢性應(yīng)激對(duì)大鼠行為和免疫細(xì)胞熱休克蛋白70表達(dá)的影響［J］.心理學(xué)報(bào)，2007，6:63-69.

［4］王克林.早期干預(yù)對(duì)降低中國(guó)艾滋病死亡率的意義［J］.公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006，17(5):118.

［5］Ko KM，Mak DH，Chiu PY and Poon MK.Pharmacological basis of Yang-invigoration’in Chinese medicine［J］.TRENDS in Pharmacological Sciences，2004，25(1):3-6.