黃芪葛根湯對2型糖尿病大鼠心肌病變的影響＊

陳艷芬，李衛(wèi)民，高 英△，吳清和，唐春萍，楊超燕，陶曙紅

(1.廣東藥學院中藥學院，廣州 510006;2.廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣州 510006)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是一種獨立于冠心病、高血壓、先心病和其他類型心臟病之外的特異心臟病變，是導致糖尿病患者心衰的重要原因［1］，其病理改變主要表現(xiàn)為心肌細胞肥大、凋亡、灶性壞死和心肌間質(zhì)纖維化。該病臨床上很難早期發(fā)現(xiàn)，發(fā)病機制尚未完全明了，預防和治療仍不完善，因此動物模型報道不多。臨床和實驗證明，黃芪、葛根單用或配伍應用對糖尿病心血管并發(fā)癥有良好的療效，而且這些中藥也是臨床用于治療冠心病、心肌炎等心血管系統(tǒng)疾病的常用藥物。因此，為了探討糖尿病心肌病模型建立方法以及較全面地觀察其病理改變，同時闡明黃芪葛根湯的作用，我們建立了具有高血糖、高血脂和胰島素抵抗特征的2型糖尿病大鼠模型［2］。本研究主要從組織形態(tài)、超微結(jié)構、膠原纖維、細胞凋亡等多個角度觀察大鼠心肌病理改變及藥物的干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級 SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～220g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心(合格證號粵監(jiān)證字2008A020)，飼養(yǎng)環(huán)境符合醫(yī)學實驗動物環(huán)境設施要求。

1.1.2 藥物與試劑 黃芪葛根湯(HGD)浸膏每1g相當于生藥1.71g;鹽酸羅格列酮(Rsg)貴州圣濟堂制藥有限公司生產(chǎn)(批號20070502);鏈脲佐菌素(STZ)美國Sigma公司產(chǎn)品;TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒德國羅氏公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 日本NIKON E600顯微鏡，日本OLYMPUS BX51顯微鏡，日立H-600透射電鏡。

1.2 方法

1.2.1 模型建立、分組與給藥 大鼠先用高脂高熱量飼料(高脂飼料由基礎鼠料加酪蛋白、蔗糖、豬油等按比例組成，其中基礎鼠料52%，酪蛋白12%，蔗糖10%，豬油24%，磷酸氫鈣2%，復合多維0.1%，礦物質(zhì)0.4%，鹽0.2%)喂養(yǎng)4周，然后以STZ 30mg/kg腹腔注射，1周后取血測空腹血糖(FBG)和糖耐量。選擇糖耐量異常(2hBG≥7.8mmol/L)的60只成模大鼠納入實驗。成模大鼠隨機分成5組(模型組、Rsg組、HGD高、中、低劑量組)，繼續(xù)以高脂飼料喂養(yǎng)8周。正常組10只大鼠一直采用基礎飼料喂養(yǎng)。各組按體質(zhì)量分別灌胃給藥(10ml/kg)，每天1次，持續(xù)8周，正常組和模型組則給予等體積的蒸餾水。

1.2.2 標本采集與指標檢測 實驗結(jié)束當天經(jīng)腹主動脈取血后處死各組動物，迅速開胸取出心臟，剪除包膜、血管，用冰生理鹽水洗凈，將小部分左心室切成1mm3小塊，3%戊二醛迅速固定，4℃保存待做電鏡標本;取部分心肌組織，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，制成4μm切片，分別供 HE染色、Masson染色和TUNEL實驗用。

1.2.3 TUNEL檢測心肌細胞凋亡 切片脫蠟至水，PBS洗3遍，50μL/mL蛋白酶 K處理，37℃20min;PBS洗3遍，3%H2O2-甲醇，室溫封閉15min，PBS洗3遍，置4℃的0.1mol/L檸檬酸鈉(內(nèi)含0.1%TritonX-100)8min;PBS洗3遍，加 TdT標記Bio-dUTP(TdT標記反應混合液)，37℃孵育60min。PBS洗3遍，加入Protection kit-POD，37℃避光孵育30min;PBS洗3遍，DAB顯色、水洗;蘇木素復染、水洗，脫水、透明、封片。心肌細胞核(圓形或橢圓形)位于心肌細胞中央，其中凋亡細胞核棕黃色，正常細胞核藍色。陰性對照細胞核全部藍色，陽性對照細胞核全部呈棕黃色。每個標本隨機選取10個高倍視野(×400)，用圖像分析軟件計數(shù)凋亡細胞核和正常細胞核，以凋亡細胞核與所有細胞核比值的平均值作為細胞凋亡指數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行分析處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 HE染色觀察心肌組織形態(tài)學

由圖1可見，糖尿病大鼠成模8周后，模型組心肌細胞排列紊亂、疏松，心肌細胞肥大且嚴重變性，甚至空泡變，細胞核固縮、裂解，間質(zhì)炎性細胞、成纖維細胞增生，心肌間質(zhì)有膠原纖維沉積。HGD高、中劑量組心肌細胞基本排列整齊，部分病變區(qū)有心肌細胞肥大、變性，心肌間質(zhì)少見膠原纖維沉積;低劑量組心肌細胞排列紊亂，有的細胞核固縮、裂解;Rsg組心肌細胞排列有些紊亂，肌纖維腫脹，部分心肌細胞肥大、變性;正常組心肌組織結(jié)構正常，細胞排列整齊、致密。

2.2 Masson染色觀察心肌膠原纖維

正常組心肌細胞染成紅色，膠原纖維藍色，心肌膠原纖維分布均勻。圖2顯示，模型組心肌細胞間質(zhì)、血管周圍可見膠原成分堆積，分布不均勻，排列紊亂，相互連接成網(wǎng)狀。各藥物組心肌膠原纖維分布較均勻，HGD低劑量組稍差，心肌細胞間質(zhì)、血管周圍見少量膠原成分。采用Image ProPlus圖像分析系統(tǒng)進行心肌組織膠原相對含量測定(見圖3)，結(jié)果表明，與正常組比較模型組大鼠心肌組織膠原相對含量明顯增加(P＜0.01);與模型組比較，HGD高、中、低劑量能不同程度減少心肌組織膠原相對含量(P＜0.01～P＜0.05)，提示該藥可以明顯抑制膠原纖維增生，Rsg組也能明顯減少膠原相對含量(P ＜0.05)。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)學改變(HE染色×100)Figure 1 Representative photomicrograph of myocardial tissue morphological changes，stained with hematoxylineosin( ×100).A:Control group，B:Diabetic model group，C:High-dose of HGD group，D:Middle-dose of HGD group，E:Low-dose of HGD group，F(xiàn):Rosiglitazone group.

2.3 透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構

正常組心肌細胞排列整齊，閏盤清晰、連續(xù)，結(jié)構完整。胞漿充滿大量縱向平行排列的肌原纖維，形成明暗相間的肌節(jié)結(jié)構。胞漿中有豐富的線粒體，結(jié)構完整，嵴密集、排列有序且充滿整個線粒體。模型組心肌細胞的肌原纖維排列紊亂、斷裂、分離、局部溶解，閏盤扭曲模糊斷裂，肌漿網(wǎng)擴張;核膜不完整并呈節(jié)段性溶解消失病變，異染色質(zhì)凝聚;線粒體增多非常明顯且呈堆積狀，線粒體腫脹變性，嵴斷裂、溶解，線粒體基質(zhì)溶解、消失，形成多個空泡區(qū);心肌細胞可見糖原顆粒和脂滴沉著，還可見到髓樣小體。HGD高劑量組肌原纖維排列整齊，線粒體和細胞核形態(tài)正常，與正常組相似。中劑量組心肌超微結(jié)構也比較正常，低劑量組肌原纖維排列有紊亂現(xiàn)象，局部出現(xiàn)肌絲溶解、斷裂病變，但較模型組有所改善。Rsg組肌原纖維排列基本整齊，線粒體和細胞核形態(tài)基本正常，個別有畸形與腫脹病變，心肌細胞可明顯見到脂滴沉著(見圖4)。

圖2 各組大鼠心肌膠原纖維改變(Masson染色×200)Figure 2 Representative photomicrograph of myocardial collagen fibers change，stained with masson trichrome(×200)

圖3 各組大鼠心肌膠原相對含量比較Figure3 Collagen relative contents through image analysis of masson trichrome.Control:Control group，Model:Diabetic model group，HGD-H:High-dose of HGD group，HGD-M:Middle-dose of HGD group，HGD-L:Low-dose of HGD group，Rsg:Rosiglitazone group.▲▲ P ＜0.01 vs control; ＊＊ P ＜0.01，*P＜0.05 vs model(±s，n=10)

2.4 TUNEL實驗檢測心肌細胞凋亡

實驗結(jié)果顯示，糖尿病心肌病變模型組大鼠陽性細胞遠遠多于正常對照組(P＜0.01)，說明模型組心肌細胞存在凋亡增加現(xiàn)象。藥物干預后有不同程度凋亡細胞的表達，HGD高劑量、中劑量組、Rsg組的凋亡指數(shù)與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，HGD低劑量組的陽性表達高于其他藥物組(見圖5、圖6)。

3 討論

圖4 各組大鼠心肌超微結(jié)構改變Figure4 Myocardial ultrastructural changes in rats observed by transmission electron microscopy.

糖尿病心肌病變于1974年由Hamby等首先提出，其作為糖尿病的一種獨特的心臟并發(fā)癥目前已得到公認，其主要病理改變?yōu)樾募〖毎蚀?、凋亡、壞死，肌絲纖維大量丟失，心肌細胞外間質(zhì)有不溶性膠原蛋白積聚和纖維化［3，4］，這種結(jié)構方面的病變將導致心肌收縮和舒張功能降低，易并發(fā)心力衰竭及心律失常。本病屬中醫(yī)消渴并發(fā)“心悸”、“胸痹”范疇，常以益氣養(yǎng)陰為基本治療原則。黃芪、葛根為中醫(yī)臨床常用藥對，二者對糖尿病、心血管疾病均有良好療效，許多中成藥玉泉丸、消渴丸、天芪降糖膠囊等都含有此藥對。黃芪葛根湯源自《證治匯補》，方中葛根甘涼生津止渴，升脾中清陽，輸津液以溉五臟而滋陰清熱。黃芪甘溫益氣健脾，取其氣復津還之意，二者相配益氣養(yǎng)陰、生津止渴，古今用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療。

本研究采用HE染色觀察大鼠一般組織形態(tài)學改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組比較，模型組在組織形態(tài)學方面發(fā)生明顯的心肌病理改變，即心肌細胞排列紊亂、疏松，心肌細胞肥大、嚴重變性，成纖維細胞增生，心肌間質(zhì)膠原纖維增生。而HGD各劑量組不同程度抑制這種心肌病變，尤其是高、中劑量心肌細胞基本排列整齊，僅部分病變區(qū)有心肌細胞肥大、變性，心肌間質(zhì)少見膠原纖維沉積。進一步采用Masson三色染色并進行圖像分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組心肌細胞間質(zhì)膠原明顯增生且分布不均勻、排列紊亂，相互連接成網(wǎng)狀，而HGD能顯著減輕心肌纖維化病變。這個結(jié)果通過進一步的心肌羥脯氨酸含量測定得到證實［5］。

圖5 各組大鼠心肌細胞凋亡情況(TUNEL×400)Figure 5 Cardiomyocyte apoptosis defected by Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling(TUNEL)method(×400)

圖6 各組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)比較Figure 6 Apoptotic index of cardiomyocyte defected by TUNEL method.▲▲ P ＜0.01 vs control; ＊＊ P＜0.01 vs model.(±s，n=10)

細胞學病變是糖尿病心肌病的一種重要病變。本研究觀察到，糖尿病模型組心肌細胞的肌原纖維排列紊亂并呈波浪狀改變，或斷裂、分離、局部溶解，閏盤扭曲模糊斷裂，肌漿網(wǎng)擴張。特別是線粒體增多非常明顯，呈堆積狀，線粒體腫脹變性，基質(zhì)溶解、消失并形成多個空泡區(qū)，心肌細胞內(nèi)見到髓樣小體。以上說明糖尿病大鼠心肌細胞明顯受到損傷，由于糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂出現(xiàn)“葡萄糖毒性”，導致心肌酶活性降低，有氧代謝不能順利進行，能量產(chǎn)生障礙，因此與能量代謝密切相關的線粒體病變較為明顯，表現(xiàn)在數(shù)量代償增多，發(fā)生腫脹、變性、嵴斷裂等改變。實驗結(jié)果還證實，HGD高、中劑量能明顯抑制這種心肌的超微結(jié)構改變，在肌原纖維、線粒體、細胞核等各個方面的表現(xiàn)都明顯優(yōu)于模型組。

心肌細胞凋亡在各種心臟疾病的發(fā)病機制中都起著重要的作用［6，7］，過度的心肌細胞凋亡將導致心肌缺血、心力衰竭等病變。國內(nèi)外眾多研究表明，糖尿病心肌病心肌細胞存在凋亡現(xiàn)象［8］，主要是因為高血糖時氧化應激增加，信號傳導路徑改變，導致基因表達異常，激活細胞程序化死亡，灶性壞死以及壞死區(qū)被纖維組織取代形成瘢痕，同時凋亡也可以導致細胞內(nèi)活性氧增多，而心肌細胞間質(zhì)纖維沉積及纖維化是糖尿病心肌病的另一重要因素。本研究利用TUNEL實驗測得糖尿病大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)較正常對照組高，而HGD高、中劑量能顯著降低凋亡指數(shù)，提示該藥可以通過干擾心肌細胞凋亡程序而保護心肌，其機理有待于進一步的研究。

綜上所述，本研究建立的大鼠糖尿病心肌病變模型具有心肌細胞肥大、凋亡、壞死，心肌間質(zhì)纖維化的典型心肌病病理特征，因此采用這種造模方法能復制與臨床發(fā)病機制接近的糖尿病心肌病變模型。黃芪葛根湯從宏觀的組織形態(tài)和微觀的超微結(jié)構都能明顯地防止或延緩糖尿病心肌病變的發(fā)生發(fā)展。羅格列酮是臨床常用的胰島素增敏劑，國內(nèi)外也有文獻報道該藥可以用于治療糖尿病心血管并發(fā)癥的治療。我們的研究證實，該藥能顯著改善胰島素抵抗且具有一定的心肌保護作用，但在改善心肌病理形態(tài)學的長效作用方面可能略顯不足。

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