補(bǔ)腎健脾方對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥細(xì)胞因子水平的影響

王明樂

(河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，洛陽 471003)

骨質(zhì)疏松癥(ostoeporosis，簡(jiǎn)稱OP)是以骨量減少、骨組織微細(xì)結(jié)構(gòu)退行性改變?yōu)樘卣鳎谴嘈栽黾?，易發(fā)生骨折的一種全身代謝性骨病。目前對(duì)骨質(zhì)疏松癥的西藥治療主要有骨吸收抑制劑和骨形成促進(jìn)劑，雖然治療藥物較多，但有確切療效的很少見。本研究通過去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型，研究補(bǔ)腎健脾方對(duì)血清 IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1等細(xì)胞因子水平的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑

補(bǔ)腎健脾方由河南科技大學(xué)天然藥物化學(xué)教研室提供，每1g含生藥2g，用蒸餾水將藥物配成每毫升含生藥 0.5g混懸液，置4℃冰箱備用(批號(hào)20081102)，購(gòu)自北京四環(huán)制藥二廠，取一類藥片5mg，充分研細(xì)，用時(shí)用蒸餾水稀釋至所需濃度。大鼠給藥量按文獻(xiàn)方法折算［1］。大鼠血清IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1ELISA測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海名典生物工程公司，為美國(guó)R＆D分裝試劑。

1.2 動(dòng)物

60只雌性6月齡清潔級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量270±10g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物飼養(yǎng)及手術(shù)操作 將60只大鼠進(jìn)行1周適應(yīng)性飼養(yǎng)，將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)(n=15)和去卵巢組(OVX)(n=45)。

手術(shù)過程:先將大鼠采用30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行麻醉，取俯臥位于手術(shù)面板上。剪去大鼠背部中下部分被毛，碘伏消毒，在無菌條件下在背部中央做約1cm縱行切口，向兩側(cè)分離皮膚，在左右兩側(cè)腹后壁肌肉層較薄弱處打開腹腔，視野中可見乳白色發(fā)亮的脂肪團(tuán)，卵巢即包埋其中。用無齒鑷夾住脂肪團(tuán)輕輕提出切口外，分離脂肪團(tuán)，可見粉紅色卵巢，用小號(hào)止血鉗在子宮末端與卵巢之間的最細(xì)處夾閉，手術(shù)縫合線接扎后，用眼科剪將卵巢全部切除，松開止血鉗將子宮輕輕還入腹腔，分別縫合肌肉層和皮膚對(duì)皮后，酒精棉球清理手術(shù)切口。Sham組大鼠在將卵巢提出體外后，僅切除部分卵巢周圍的脂肪組織，其他操作同OVX組。

按每籠5只分籠飼養(yǎng)。各組間大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，每日觀察活動(dòng)、飲食等一般狀況，每月稱量體質(zhì)量1次。采用顆粒飼料按照Sham組大鼠攝食量喂養(yǎng)，自由飲水，室溫保持22℃，相對(duì)濕度60%，每日光照12h(8am～8pm)。

1.3.2 分組及給藥 大鼠全部蘇醒后，將OVX組大鼠隨機(jī)分為3組，即陽性對(duì)照、補(bǔ)腎健脾方組和去卵巢模型組，每組15只。

術(shù)后1周開始給藥，陽性對(duì)照組，口服灌胃給予尼爾雌醇，每2周1次，0.21mg/kg體質(zhì)量，每次2ml;補(bǔ)腎健脾方組口服灌胃給予補(bǔ)腎健脾方，生藥含量為0.5g/ml，每次2ml，每天1次;假手術(shù)組和去卵巢組給予同劑量的自來水。

1.3.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法 實(shí)驗(yàn)過程中，所有大鼠自由飲水?dāng)z食，每月稱量1次體質(zhì)量，大鼠處死前稱量體質(zhì)量。大鼠處死后取出子宮，稱量子宮質(zhì)量，并記算子宮指數(shù)，子宮指數(shù)=子宮濕重(g)/體質(zhì)量(kg)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，禁食1d，自由飲水，將全部大鼠股動(dòng)脈放血處死，將全血轉(zhuǎn)移至標(biāo)記的離心管中，4℃靜置30min后，以2000g在4℃離心20min，分離血清用于血清細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，各組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎健脾方對(duì)去卵巢大鼠體質(zhì)量及子宮重量的影響

表1顯示，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)各組動(dòng)物體質(zhì)量之間未見有差別。隨著時(shí)間變化，各組大鼠體質(zhì)量逐漸增加，均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但其增長(zhǎng)在各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與假手術(shù)組比較，去卵巢組大鼠的子宮重量及子宮系數(shù)均明顯降低(P＜0.01)，經(jīng)尼爾雌醇和補(bǔ)腎健脾方治療后子宮重量及子宮系數(shù)顯著增高(P＜0.01)。

表1 補(bǔ)腎健脾方對(duì)去卵巢大鼠體質(zhì)量及子宮濕重的影響

2.2 補(bǔ)腎健脾方對(duì)去卵巢大鼠血清IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1 的影響

與假手術(shù)組比較，去卵巢組大鼠IL-6和TNF-a水平顯著升高，IL-4和IGF-1水平顯著降低(P＜0.01)，尼爾雌醇和補(bǔ)腎健脾方治療后，能降低IL-6和TNF-a水平，提高IL-4和IGF-1水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 補(bǔ)腎健脾方對(duì)去卵巢大鼠血清IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1的影響

3 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種多病因的增齡性病變，隨著老齡化社會(huì)的到來越來越受到人們的重視。目前認(rèn)為本病主要與年齡、內(nèi)分泌紊亂、鈣吸收不良以、免疫、遺傳、營(yíng)養(yǎng)與生活方式等因素有關(guān)，主要臨床表現(xiàn)為胸背部和下腰部疼痛、畸形及骨折。骨質(zhì)疏松大鼠模型的制作方法主要有維甲酸、去卵巢和糖皮質(zhì)激素造模3種，采用雌性大鼠雙側(cè)卵巢切除方法進(jìn)行造模，是研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMO)的經(jīng)典模型［2］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，PMO是一種由于女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平下降導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥，因此雌激素替代療法(ERT)是當(dāng)前防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的首選方法，然而長(zhǎng)期使用雌激素會(huì)增加乳腺癌、腦卒中、心肌梗死、膽囊炎以及血栓形成等發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

中醫(yī)學(xué)上把骨質(zhì)疏松癥歸屬為“虛勞”、“骨痹”、“骨痿”范疇。根據(jù)中醫(yī)“腎主骨”理論，腎精不足、腎氣虛衰是導(dǎo)致原發(fā)性骨質(zhì)疏松的重要原因，用來治療骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)藥組方多從補(bǔ)腎著手，補(bǔ)腎藥物可通過補(bǔ)腎益脾達(dá)到補(bǔ)骨的作用。近年來，在臨床和基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)很多富含植物雌激素的單味中藥如淫羊藿、大豆、骨碎補(bǔ)等及其提取物、中藥復(fù)方具有明顯的抗骨質(zhì)疏松作用［3～9］。

在骨代謝過程中，成骨細(xì)胞不斷形成新骨，破骨細(xì)胞不斷吸收舊骨，骨組織的形成和吸收達(dá)到一種動(dòng)態(tài)的平衡，因此血清生化指標(biāo)能反映骨組織的變化。TNF-a是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的的一種細(xì)胞因子，主要作用于破骨細(xì)胞，使破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，是一種骨吸收促進(jìn)劑，能抑制骨形成。IL-6是由激活的淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、骨髓細(xì)胞合成和分泌，它是破骨細(xì)胞主要的調(diào)節(jié)因子之一，能夠刺激破骨細(xì)胞的增殖和功能表達(dá)。IL-4也是影響破骨細(xì)胞的1個(gè)細(xì)胞因子，能與其他細(xì)胞因子、激素協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞形成及骨吸收。IL-4是一種骨吸收抑制劑，可以抑制破骨細(xì)胞及其前體。類胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)由成骨細(xì)胞合成，是骨骼中最豐富的生長(zhǎng)因子。IGF-1可促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化，抑制凋亡，是促進(jìn)骨形成的重要因素［10］。

本研究結(jié)果表明，去卵巢后大鼠體質(zhì)量增加，子宮質(zhì)量減輕，IL-6和TNF-a水平顯著升高，IL-4和IGF-1水平顯著降低，說明造模成功。用藥組與模型組比較，均降低了IL-6和TNF-a水平，提高了IL-4和IGF-1水平，說明補(bǔ)腎健脾方極可能通過IL-6、IL-4、TNF-a、IGF-1等細(xì)胞因子起到治療骨質(zhì)疏松的作用。

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