HPLC法測定祛疣解毒膠囊中芍藥苷的含量

范 斌，聶穎蘭，彭 娟，閆 寒，郭 娜

(中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700)

祛疣膠囊為醫(yī)院自制制劑，是由穿山甲、紫草、赤芍等多味藥材制成的中藥復(fù)方制劑，具有解毒除濕、活血散瘀、軟堅(jiān)祛疣的功效，可用于濕毒蘊(yùn)結(jié)、氣血瘀滯引起的皮膚病。用高效液相色譜法測定祛疣膠囊中芍藥苷的含量［1～3］，結(jié)果無干擾、重復(fù)性好，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

美國Agilent1200高效液相色譜儀;G1311A四元泵;G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器;G1316A柱溫箱;Agilent chemstation化學(xué)工作站;賽多利斯 arium!61316/611VF超純水處理器;賽多利斯 BT25S、BT423S分析天平;電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;離心機(jī) Anke TDL-5-A，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 試劑

甲醇-色譜純、乙酸-色譜純(北京迪科馬科技有限公司)，無水乙醇-分析純(北京化工廠)，超純水為自制。

1.3 對照品

芍藥苷由中國藥品生物制品檢定所提供(批號(hào)110736-200732)。

1.4 樣品來源

3批祛疣解毒膠囊均由北京市朝陽區(qū)雙安醫(yī)院提供(批號(hào) 100401、100402、100403)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters SunfireTMC18(150×3.9mm，5μm)，甲醇 －0.1% 醋酸水(22∶78)為流動(dòng)相，流速1.0ml/min，柱溫 35℃，檢測波長 230nm，進(jìn)樣量10ul。

2.2 對照品溶液制備

稱取芍藥苷對照品適量，精密稱定，于5ml容量瓶中，以甲醇為溶劑定容，制成每 1ml含芍藥苷4.858mg的儲(chǔ)備溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取膠囊內(nèi)容物0.2g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入無水乙醇20ml稱重，回流提取20 min，放置室溫，補(bǔ)重、離心 10 min(4000r·min－1)，精密吸取上清液5ml，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，以流動(dòng)相復(fù)溶殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至5ml容量瓶中，流動(dòng)相定容、搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 陰性供試品溶液的制備

按處方比例取除赤芍外的其他藥材，以相同工藝制備，按“2.3”項(xiàng)下方法制成缺赤芍的陰性供試品溶液。

2.5 專屬性試驗(yàn)

取芍藥苷對照品溶液，供試品溶液，陰性供試品溶液分別注入HPLC測定，記錄色譜圖。供試品色譜圖中，在與對照品相應(yīng)的位置上，有一相同保留時(shí)間的色譜峰，陰性供試品溶液無干擾(見圖1)。

圖1 芍藥苷HPLC色譜圖A.對照品溶液;B.供試品溶液;C.陰性供試品溶液，1.芍藥苷

2.6 線性關(guān)系考察

精密吸取芍藥苷對照品儲(chǔ)備溶液適量，以流動(dòng)相為溶劑，配制系列濃度為6.0725、12.145、24.25、48.58、97.16ug·mL－1的芍藥苷對照品溶液，測定峰面積，以對照品的濃度為橫坐標(biāo)，以對照品峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。芍藥苷線性范圍6.0725～97.16 ug·mL－1，回歸方程為 Y=12.206X-21.58，r=0.9997。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10μL，在所確定的HPLC條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，求得峰面積平均值為385.0，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD為1.0%，表明該色譜條件精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一供試品溶液10μL，分別于0、2、4、6、8、24h依次進(jìn)樣，測得芍藥苷的峰面積平均值RSD為3.2%。試驗(yàn)結(jié)果表明，樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品按“2.3項(xiàng)下”方法平行制備6份供試品溶液，在所確定的HPLC條件下進(jìn)行測定，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品含量。結(jié)果平均含量3.1469mg·g－1，RSD 為 1.7%，表明方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

表1顯示，采用加樣回收法，稱取6份已知含量(3.1469 mg·g－1)同一批號(hào)樣品各 0.2g，精密稱定。分別加入芍藥苷對照品適量，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備及上述色譜條件測定。按加樣回收率計(jì)算公式［1］:回收率%=(實(shí)測值-供試品所含被測成分量)/加入對照品量×100%。

2.11 樣品含量測定

表2顯示，分別取3批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算供試品的芍藥苷的含量。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 樣品測定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 色譜分離條件的考察

該方中的赤芍主要成分為芍藥苷，參考中國藥典赤芍中芍藥苷含量測定方法色譜柱為Diamonsil C18(2)4.6mm ×250mm，5um，以 0.05mol·L 磷酸二氫鈉(A)-甲醇(B)為流動(dòng)相，調(diào)整 A/B(55/45，70/30，75/25，80/20)不同比例，觀察不同條件下供試品芍藥苷的色譜圖或芍藥苷與干擾峰分離度不好，或芍藥苷峰形不對稱。改善藥典方法，改變流動(dòng)相為0.1%醋酸水(A)-甲醇(B)，并換色譜柱Waters SunfireTMC18150×3.9mm，5μm，芍藥苷峰形對稱，進(jìn)一步考察 A/B(70/30、75/25、78/22)不同比例，最后確定最優(yōu)色譜條件色譜柱:Waters SunfireTMC18(150×3.9mm，5μm)，甲醇 －0.1% 醋酸水(22∶78)為流動(dòng)相，流速1.0ml/min，柱溫35℃。該方法在藥典赤芍中芍藥苷含量測定方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了具體的改善和條件優(yōu)化，測定祛疣膠囊中芍藥苷的含量專屬性及重復(fù)性好，且簡單快速。

3.2 樣品前處理方法的考察

選取考察回流提取與超聲提取，回流提取測得供試品含量為2.7698 mg·g－1，超聲提取測得含量為2.0724mg·g－1。結(jié)果顯示，回流提取效率明顯高于超聲提取?？疾旎亓魈崛〉臅r(shí)間分別為20、30、45、50、60min，提取效率無明顯的差異，考慮節(jié)約能源，故選擇提取時(shí)間為20min。

［1］中國藥典委員會(huì).《中國藥典》2005年版［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

［2］李霞，韓曼雪，董衛(wèi)紅，等.高效液相色譜法測定正柴胡飲顆粒中芍藥苷的含量［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2010，16(5):427-428.

［3］王巧，劉榮霞，畢開順，等.HPLC法測定白芍總苷膠囊中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷［J］.中草藥，2005，36(11):，1630-1632.