HPLC法測定恩諾沙星可溶性粉含量

謝玉榮,吳少玲,李 強(qiáng),張 瀅

(海南省獸藥飼料監(jiān)察所, 海南 海口 570203)

恩諾沙星作為動物專用的殺菌性廣譜抗菌藥物，對大多數(shù)革蘭氏陰性菌、部分革蘭氏陽性菌及某些支原體、衣原體等均有效，已廣泛用于豬、牛、禽、犬、貓和水生動物的敏感細(xì)菌及支原體所致的消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及皮膚軟組織的各種感染性疾病[1]。恩諾沙星可溶性粉作為恩諾沙星的一種主要劑型，主要用于雞大腸桿菌病、雞白痢、雞巴氏桿菌病和雞敗血性支原體病等[2]。現(xiàn)今較多學(xué)者運(yùn)用紫外分光光度法測定恩諾沙星的含量，如趙成等[3]運(yùn)用紫外分光光度法測定恩諾沙星注射混懸劑的含量，又如張慧輝等[4]運(yùn)用紫外分光光度法測定恩諾沙星納米乳的含量測定。HPLC法是藥物含量測定應(yīng)用最為廣泛的方法，本文首次考察HPLC法[5]是否適用于恩諾沙星可溶性粉的含量測定，并將測定結(jié)果與《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版中紫外分光光度法[6]的測定結(jié)果比較，證實該法準(zhǔn)確可行。

1 材料與方法

1.1 材 料

Waters 2695 型高效液相色譜儀，2489 紫外檢測器；島津 UV-160A型紫外分光光度計；恩諾沙星對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量99.9 %，批號H0081206)；恩諾沙星可溶性粉(1)海南育奇藥業(yè)，規(guī)格10 %，批號120701；(2)廣州燕唐生物科技有限公司，規(guī)格2.5 %，批號20121201；(3)河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，規(guī)格2.5 %，批號12090322；(4)廣西神達(dá)工貿(mào)有限公司神達(dá)獸藥(原料)廠，規(guī)格2.5 %，批號2012.1.1.03；以下用編號表示)。乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 方 法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Waters Symmetry C18柱(4.6 × 150 mm，5 μm)，流動相為0.025 mol/L磷酸(用三乙胺調(diào)節(jié)pH至3.0)- 乙腈(83∶17)，檢測波長為278 nm，柱溫25 ℃, 流速 1.0 mL/min。

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 對照品溶液的制備 取105 ℃干燥至恒重的恩諾沙星對照品25 mg，精密稱定，置50 mL的量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度，搖勻；精密量取5 mL至50 mL量瓶中，加流動相定容稀釋制成50 μg/mL的對照品溶液。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 取恩諾沙星可溶性粉適量(約相當(dāng)于恩諾沙星25 mg)，精密稱定，同對照品方法制成50 μg/mL 的供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

分別取對照品溶液、供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，如圖1所示。理論塔板數(shù)為5 000左右，均大于2 500，保留時間約為4.5 min。

2.2 線性關(guān)系試驗

取105 ℃干燥至恒重的恩諾沙星對照品50 mg，精密稱定，置250 mL的量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度，搖勻，作為儲備液。精密吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL分別置于10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，即制得20、30、40、50、60、70、80 μg/mL的系列對照品溶液，依次取10 μL進(jìn)樣記錄色譜圖。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：A=69376C-32435(n=7，r=0.9998)，如圖2所示。表明在20～80 μg/mL的范圍內(nèi)，恩諾沙星濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 A和B分別為恩諾沙星對照品及恩諾沙星可溶性粉的色譜圖
Fig.1 A and B are the chromatogram for enrofloxacin
standard and enrofloxacin soluble powder

圖2 恩諾沙星線性曲線圖Fig.2 Linear curve of enrofloxacin

2.3 重復(fù)性試驗

取恩諾沙星可溶性粉(以海南育奇藥業(yè)有限公司產(chǎn)品進(jìn)行考察)，按1.2.2.1制備5份供試品溶液，測定供試品中恩諾沙星的含量為98.2 %， RSD為0.76 %，表明該法的重復(fù)性良好。

2.4 檢測限與定量限試驗

取1.2.2.1中的恩諾沙星對照品溶液，用流動相逐級稀釋，記錄色譜圖，以信噪比為3:1時測定檢測限，信噪比為10:1時測定定量限。信噪比為3:1時測得檢測限為15 ng/mL，信噪比為10:1時定量限為50 ng/mL。

2.5 專屬性試驗

以海南育奇藥業(yè)有限公司產(chǎn)品為例，通過測定恩諾沙星的主要降解產(chǎn)物環(huán)丙沙星和空白輔料，考察本法的專屬性。取鹽酸環(huán)丙沙星對照品適量精密測定，按照1.2.2.1中的方法制成50 μg/mL的溶液；另取空白輔料(約與25 mg恩諾沙星相當(dāng)?shù)奶幏捷o料量)按照1.2.2.1中的方法制成相應(yīng)的空白輔料溶液。分別取上述兩種溶液進(jìn)樣，記錄色譜圖如圖3所示。由圖3可看出，恩諾沙星保留時間約為4.4 min，主要雜質(zhì)鹽酸環(huán)丙沙星保留時間約為3.4 min，兩者均在色譜柱上有適當(dāng)保留，且峰形良好；空白輔料不出現(xiàn)與恩諾沙星及鹽酸環(huán)丙沙星保留時間一致或相融合的峰，因而輔料不干擾恩諾沙星及雜質(zhì)的測定。

圖3 恩諾沙星可溶性粉專屬性試驗Fig.3 Specificity test of enrofloxacin soluble powder

2.6 耐用性試驗

本試驗通過改變HPLC法的柱溫、流動相的比例、流速和pH，以及采用不同的色譜柱、不同儀器考察本法的耐用性。將考察結(jié)果與本法結(jié)果比較，結(jié)果如表1所示，表1說明本法耐用性良好。

表1 耐用性試驗Table 1 Durability Test

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液(對海南育奇藥業(yè)有限公司產(chǎn)品進(jìn)行考察)，在室溫下放置，分別于0、1、3、5 h時進(jìn)樣測定恩諾沙星含量，得RSD為0.40 %，表明供試品在5 h內(nèi)仍保持其穩(wěn)定性，不影響含量測定結(jié)果。

2.8 回收加樣試驗

取海南育奇藥業(yè)有限公司供試品約0.127 g(約相當(dāng)于12.5 mg恩諾沙星)9份，置25 mL的量瓶中，每三份分別加入標(biāo)示量80 %、100 %、120 % 的對照品，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 mL至100 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度制成理論濃度在線性范圍內(nèi)的供試品溶液，依次取10 μL進(jìn)樣，計算回收率，所得結(jié)果見表2。由表2可知，回收率平均值為99.3 %，RSD為0.40 %，表明本法準(zhǔn)確度良好。

表2 回收加樣試驗Table 2 Sample recovery test

2.9 供試品含量測定

運(yùn)用上述HPLC法和紫外分光光度法[3]對來自四個不同廠家的恩諾沙星可溶性粉進(jìn)行含量測定，將兩法測定結(jié)果進(jìn)行比較，所得結(jié)果見表3。HPLC法與紫外分光光度法測定的結(jié)果相近，說明HPLC法準(zhǔn)確可靠。

3 討 論

本研究運(yùn)用HPLC法測定恩諾沙星可溶性粉的含量，并對該法進(jìn)行較為完整的方法學(xué)研究。在系統(tǒng)適應(yīng)性試驗中，恩諾沙星可溶性粉出峰時間為4.5 min，在短柱上能有極佳的保留，無論對照品或供試品，理論塔板數(shù)均大于5 000，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于規(guī)定的2 500，峰形好，無拖尾，系統(tǒng)適應(yīng)性試驗的各項參數(shù)都較為理想；回收加樣試驗與重復(fù)性試驗結(jié)果表明該法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度；專屬性試驗說明該法抗干擾程度大，輔料及主要雜質(zhì)鹽酸環(huán)丙沙星存在時，在得到有效分離的同時對恩諾沙星測定結(jié)果幾無干擾；穩(wěn)定性試驗結(jié)果說明恩諾沙星可溶性粉的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在5 h內(nèi)檢測結(jié)果變化微小，無降解或變質(zhì)現(xiàn)象產(chǎn)生；耐用性試驗則進(jìn)一步驗證了該法在一定范圍內(nèi)改變柱溫、流動相比例、流速、流動相pH值，甚至色譜柱、液相色譜儀時，檢測結(jié)果的變化不明顯，說明該法耐用性良好；此外還確定了該法的線性范圍、檢測限和定量限，為HPLC測定恩諾沙星可溶性粉的含量提供了可靠的試驗依據(jù)。

表3 HPLC法和紫外分光光度法含量測定結(jié)果Table 3 The assay results of HPLC and UV spectrophotometry

4 結(jié) 論

紫外分光光度法易受溶劑和雜質(zhì)的干擾，恩諾沙星降解產(chǎn)物環(huán)丙沙星在271 nm波長處存在較大的紫外吸收，對于恩諾沙星的定量干擾較大，導(dǎo)致結(jié)果偏離，因此該法不適用于成分復(fù)雜的樣品檢測。HPLC法相比于紫外分光光度法，能夠分離無關(guān)物質(zhì)，同時避免某些助溶劑或輔料對測定結(jié)果的影響，且具有良好的重復(fù)性、專屬性、耐用性和準(zhǔn)確度，能更有效地控制恩諾沙星可溶性粉的質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

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