黑番鴨VIPR-1基因第12內(nèi)含子SNP與就巢性狀關(guān)聯(lián)分析

辛清武，繆中緯，鄭嫩珠，朱志明，黃勤樓

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013)

產(chǎn)蛋量是家禽的一個極為重要的數(shù)量性狀，屬于限制性狀和低遺傳力性狀。黑番鴨年產(chǎn)蛋量較低，僅90枚左右，其較強(qiáng)的就巢性是繁殖力較低的主要原因。由于家禽就巢性狀的遺傳力較低，國內(nèi)外眾多家禽研究者將目光集中在與生殖內(nèi)分泌相關(guān)的基因上，以期闡明家禽的就巢機(jī)制，降低或阻止家禽就巢來提高繁殖力。

催乳素(prolactin，PRL) 被認(rèn)為是引起家禽就巢行為發(fā)生和維持的關(guān)鍵因素，而血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)是公認(rèn)的PRL釋放因子，能促進(jìn)PRL的分泌[1-8]。VIP通過位于細(xì)胞膜上的受體(vasoactive intestinal peptide receptor，VIPR)發(fā)揮其生理功能，已經(jīng)證明禽類腺垂體PRL細(xì)胞的細(xì)胞膜上有VIPR-1，VIPR-1與VIP 在腺垂體特異性結(jié)合是引起PRL重新合成與分泌的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一步[9-10]。目前，國內(nèi)外對黑番鴨及家鴨VIPR-1基因的報道極少，鄭嫩珠等[11]對黑番鴨VIPR-1的cDNA序列進(jìn)行了克隆，并獲得黑番鴨的部分cDNA序列。辛清武等[12]以黑番鴨基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取了黑番鴨VIPR-1基因第5外顯子(101 bp)、第5內(nèi)含子 (1 630 bp) 、第6外顯子 (133 bp)、第12外顯子 (42 bp)、第12內(nèi)含子 (1 455 bp) 的完整序列和第13外顯子 (176 bp) 的部分序列。

本研究以鴨VIPR-1基因作為影響鴨就巢性狀的候選基因，選用就巢黑番鴨和非就巢黑番鴨為研究對象，通過PCR-RFLP和測序方法，對VIPR-1基因進(jìn)行多態(tài)性檢測，并進(jìn)行相關(guān)性分析，研究該基因?qū)诜喚统残袨榈挠绊?，為黑番鴨的保護(hù)、開發(fā)利用及分子標(biāo)記輔助育種工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

本研究以黑番鴨為試驗(yàn)材料，頸靜脈采血，提取總DNA，設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并采取PCR產(chǎn)物直接測序的方法尋找突變位點(diǎn)，然后再對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切與判型。

1.1 試驗(yàn)材料

選取就巢期黑番鴨68只，非就巢黑番鴨108只，采用頸靜脈采血，EDTA抗凝，-20 ℃保存?；蚪MDNA試劑盒提取總DNA，TE溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)鴨飼養(yǎng)于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所種鴨示范基地-福建省莆田市泉發(fā)種禽開發(fā)有限公司，分子生物學(xué)試驗(yàn)在福建省農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所省畜禽分子遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 主要試劑

血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠回收純化試劑盒均購自TIANGEN公司；DreamTaqGreenPCRMasterMix(2×)、Nuclease-freewater購自廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司；pMD18-T載體、DNA Marker(DL1000、DL500)、限制性內(nèi)切酶StuI均購自大連TAKARA公司。

1.3 黑番鴨VIPR-1基因多態(tài)位點(diǎn)及其引物

根據(jù)已克隆的黑番鴨VIPR-1基因內(nèi)含子12的序列，設(shè)計一對引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序，尋找該序列的突變位點(diǎn)并進(jìn)行酶切見表1。

1.4 PCR擴(kuò)增

應(yīng)用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取健康就巢黑番鴨68只、非就巢黑番鴨108只血液基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為50 μL：2 × Taq MasterMix 25 μL，上游引物(F) 1 μL，下游引物(R)1 μL，模板 DNA 2 μL ，補(bǔ)充ddH2O 至終體積50 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 50 s，53.5℃ 35 s，72℃ 45 s，共 35 個循環(huán); 72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效果。

表1 PCR引物序列信息Table 1 The amplification primer sequences

1.5 PCR產(chǎn)物的酶切與判型

將擴(kuò)增結(jié)果良好的PCR產(chǎn)物用StuI酶切，反應(yīng)體系為：10×M Buffer 2 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，StuI 1 μL，加水至20 μL，37 ℃恒溫水浴鍋中消化過夜；3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用DL1000和DL500的DNA Marker作為分子量的標(biāo)準(zhǔn)對照，觀察酶切結(jié)果，凝膠成像系統(tǒng)拍照，由帶型判斷基因型。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

計算各多態(tài)片段的基因頻率和基因型頻率，并用x2檢驗(yàn)對不同基因型在非就巢和就巢黑番鴨中的分布情況進(jìn)行顯著性分析。

基因型頻率 PAA=XAA/n；基因頻率PA=(2PAA+PAG)/2n 。式中：n 為基因型總數(shù)量；XAA為其中一種基因型數(shù)目；PAA為AA 基因型的頻率；PA為等位基因A的基因頻率。

x2=n(ad-bc)^2/[(a+b)(c+d)(a+c)(b+d)]

式中：n=a+b+c+d為樣本容量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增與測序

所提取的血樣DNA經(jīng)檢測純度較高，可用于PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物長度介于500～700 bp，擴(kuò)增片段與預(yù)期片段大小一致且特異性較好，沒有非特異性條帶見圖1，引物P的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后送往大連TAKARA公司進(jìn)行測序，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)片段中有一個核苷酸突變見圖2，位于黑番鴨VIPR-1基因第12內(nèi)含子的第988 bp(A/G)處，多態(tài)性即由此產(chǎn)生。

圖1 PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果M.Marker DL1000;1-10.PCR 產(chǎn)物Fig.1 Electrophoresis of PCR productM.Marker DL1000;1-10.PCR product

2.2 酶切結(jié)果

PCR產(chǎn)物特異性較好，沒有非特異性條帶，可用于StuI限制性內(nèi)切酶消化。經(jīng)StuI酶切該P(yáng)CR產(chǎn)物后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，該位點(diǎn)表現(xiàn)為多態(tài)性，出現(xiàn)了AG、AA、GG 3種基因型，依據(jù)條帶數(shù)和位置判定為3種基因型。其中等位基因A表現(xiàn)為607 bp一條帶；等位基因B表現(xiàn)為362 bp、245 bp兩條帶，即有1個StuI酶切位點(diǎn)。因此，AA基因型個體表現(xiàn)為1條帶(607 bp)，GG基因型個體表現(xiàn)為2條帶(362 bp、245 bp)，AG基因型個體表現(xiàn)為3條帶(607 bp、362 bp、245 bp)。就巢黑番鴨、非就巢黑番鴨部分酶切結(jié)果見圖3。

圖3 VIPR-1基因擴(kuò)增產(chǎn)物的部分StuI酶切結(jié)果1，2，6，9，12，16，19，21.AG基因型；3，4，14，17，18.AA基因型；5，7，8，10，11，13，15，20，22.GG 基因型；M.Marker DL 500Fig.3 Profiles of PCR products digested by StuI of VIPR-1 gene1，2，6，9，12，16，19，21.AG genotype；3，4，14，17，18.AA genotype；5，7，8，10，11，13，15，20，22.GG genotype；M.Marker DL 500

2.3 SNPs與就巢性狀的關(guān)系

VIPR-1基因內(nèi)含子12片段經(jīng)PCR-RFLP分析，在黑番鴨試驗(yàn)鴨群中檢測到SNPs，其基因型分布情況詳見表2。對黑番鴨試驗(yàn)鴨群進(jìn)行SNPs基因型的檢測，統(tǒng)計黑番鴨VIPR-1就巢與非就巢性狀的基因型分布情況并進(jìn)行卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)。黑番鴨就巢與非就巢性狀基因型分布結(jié)果見表3?？ǚ姜?dú)立性檢驗(yàn)結(jié)果表明黑番鴨VIPR-1基因第12內(nèi)含子的第988 bp(A/G)處突變各基因型分布在就巢與非就巢性狀中差異極顯著(P<0.01)。

表2 內(nèi)含子12片段的基因型頻率和等位基因頻率Table 2 Genotype and allele frequence of intron 12

表3 黑番鴨VIPR-1各基因型分布與就巢性狀的關(guān)系Table 3 Distribution of genotype and appearance of broodiness in the balck Mouscovy duck

3 討 論

血管活性腸肽受體-1(VIPR-1)與血管活性腸肽(VIP)在腺垂體特異性結(jié)合，可引起PRL的重新合成與分泌，可能對家禽的就巢有著重要的影響。因此，VIPR-1基因可作為研究家禽就巢性狀的重要候選基因。You等[10]克隆出火雞VIPR基因cDNA全序列，分析了VIPR在火雞不同繁殖時期在下丘腦和垂體中的表達(dá)規(guī)律，并得出VIPR在垂體中表達(dá)量的變化與火雞就巢密切相關(guān)。周敏等[13-16]研究雞VIPR基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)雞VIPR基因存在多態(tài)位點(diǎn)，這些多態(tài)位點(diǎn)與雞就巢的發(fā)生和持續(xù)時間顯著相關(guān)；通過對VIPR-1基因C1704887T和C1715301T多態(tài)位點(diǎn)與優(yōu)質(zhì)肉雞清遠(yuǎn)麻雞雞群開產(chǎn)性狀、產(chǎn)蛋性狀以及就巢性狀的相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)C1704887T對總產(chǎn)蛋數(shù)與總正常蛋數(shù)存在顯著影響；在選取VIPR-1基因的12個多態(tài)位點(diǎn)與優(yōu)質(zhì)肉雞寧都三黃雞群早期產(chǎn)蛋性狀的相關(guān)分析中，發(fā)現(xiàn)有3個多態(tài)位點(diǎn)不同基因型對母雞的早期產(chǎn)蛋性狀存在顯著影響；同時通過對雞VIPR-1基因5’(-496～-1 bp)調(diào)控區(qū)多態(tài)位點(diǎn)與雞就巢性的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)多態(tài)以及單倍型組合與就巢性狀緊密相關(guān)，可作為影響肉雞就巢行為的候選基因進(jìn)行深入研究。

本研究以與黑番鴨就巢相關(guān)的VIPR-1基因作為候選基因，利用PCR-RFLP和PCR產(chǎn)物直接測序法分析了該基因內(nèi)含子12的核苷酸變異，經(jīng)StuI酶切該P(yáng)CR產(chǎn)物后，瓊脂糖凝膠電泳檢測，該位點(diǎn)表現(xiàn)為多態(tài)性，出現(xiàn)了AG、AA、GG 3種基因型，依據(jù)條帶數(shù)和位置判定為3種基因型。其中等位基因A表現(xiàn)為607 bp一條帶；等位基因G表現(xiàn)為362 bp、245 bp兩條帶，即有1個StuI酶切位點(diǎn)。通過對就巢黑番鴨與非就巢黑番鴨個體的研究，發(fā)現(xiàn)就巢黑番鴨只有一種基因型AG(68),而非就巢黑番鴨除基因型AG(45)外，還有基因型AA(18)、GG(45)，經(jīng)卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)，就巢黑番鴨與非就巢黑番鴨兩者之間基因型的分布差異極顯著(P<0.01)。表明黑番鴨VIPR-1基因第12內(nèi)含子A988G突變與黑番鴨的就巢性狀顯著相關(guān)，為利用分子遺傳標(biāo)記輔助選擇來降低或消除黑番鴨的就巢性，最大程度上提高黑番鴨的產(chǎn)蛋性能提供了新的依據(jù)。

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