金福菇菌種液氮保藏條件的優(yōu)化研究*

陳志宏 陳炳智 謝寶貴 劉新銳

（福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌物研究中心，福州 350002）

金福菇（Tricholoma lobayense Heim）是一種高溫型食用菌，適合夏季出菇。它與草菇、靈芝、毛木耳等高溫型或中高溫型食用菌一樣，菌種在低溫（4 ℃）下保藏，經(jīng)常出現(xiàn)菌種死亡問題，而在室溫下保藏則易出現(xiàn)菌種老化。菌種保藏的目的是保持良種的優(yōu)良種性，它是良種保護(hù)的重要環(huán)節(jié)。一般地，菌種處于生長狀態(tài)，易出現(xiàn)老化，也易發(fā)生變異，菌種保藏技術(shù)研究就是為了開發(fā)出一種保藏方法，使菌種處于休眠狀態(tài)，既不生長也不死亡，以避免變異與老化。目前尚未見到金福菇菌種保藏技術(shù)的相關(guān)報(bào)道，而液氮超低溫保藏菌種已被公認(rèn)為是保持菌種特性不變和存活力持久最為理想的方法［1，2]，我們通過對金福菇菌種液氮保藏效果的降溫速率、解凍溫度兩個(gè)方面進(jìn)行研究，探索金福菇菌種的液氮保藏技術(shù)，以期應(yīng)用于金福菇種質(zhì)資源的保藏。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 金福菇“Tr0005”和“Tr0001”兩個(gè)菌株均由福建省食用菌種質(zhì)資源保藏與管理中心提供。

1.2 菌種培養(yǎng)與保藏管制作 聚丙烯飲料管剪成5 cm長，用火焰先把一端溶化封口，滅菌后備用。將已活化2次的PDA平板菌種用小號打孔器截取菌種塊，挑放于無菌聚丙烯飲料管，注入10%甘油，再用火焰封口，靜置過夜。

1.3 降溫程序設(shè)計(jì) 將制備好的保藏管用CryoGenesis（TM）V5程序降溫儀進(jìn)行4個(gè)不同降溫程序處理試驗(yàn)（表1），每個(gè)程序3個(gè)重復(fù)，35 ℃解凍。

表1 液氮保藏不同降溫程序處理

1.4 解凍溫度試驗(yàn) 從液氮罐取出表1所列的C降溫程序處理，保藏3個(gè)月后的金福菇菌種，設(shè)置4個(gè)解凍溫度，即室溫（25 ℃左右）、30 ℃、35 ℃、40 ℃，解凍時(shí)間為5 min，每個(gè)解凍處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.5 保藏效果評價(jià)方法 液氮保藏 3個(gè)月后的金福菇菌種經(jīng)解凍，菌種塊用無菌濾紙吸干防凍劑，接種于PDA平板上，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)，記錄菌絲萌發(fā)時(shí)間，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，測量菌絲的日生長速度，觀察菌落特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同降溫程序?qū)σ旱２匦Ч挠绊?對試驗(yàn)菌株按4種不同降溫程序降溫預(yù)處理后投入液氮中冷凍保藏3個(gè)月，解凍后，活化培養(yǎng)9天，測量數(shù)據(jù)、拍照。試驗(yàn)結(jié)果（圖1、表2）表明，菌種從25℃降到4 ℃的降溫速度很重要，直接放入液氮中，降溫速度太快，菌種易死亡。適合的降溫速度為7 ℃/min。

圖1 不同程序降溫保藏的菌種生長情況

表2 不同降溫程序降溫液氮保藏的效果比較

2.2 不同解凍溫度對液氮保藏效果的影響 經(jīng)3個(gè)月的液氮冷凍保藏，經(jīng)不同解凍溫度處理解凍后活化培養(yǎng)10天，測量數(shù)據(jù)、拍照。結(jié)果（表3）表明：液氮保藏后，通過不同解凍處理方法，菌株萌發(fā)時(shí)間、萌發(fā)率、生長速度有差異。35℃解凍的菌株萌發(fā)時(shí)間較短，生長速度較快，菌絲濃密。30℃解凍的菌株次之，室溫下自然解凍與 40℃條件解凍的菌株萌發(fā)率低，生長速度慢。

表3 不同解凍溫度與液氮保藏效果的關(guān)系

3 討 論

自1968年Hwang首先應(yīng)用液氮保藏食用菌菌種以來，液氮保藏因其具有的突出優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用[1，3]。但有報(bào)道不同食用菌品種菌株因未對液氮保藏的降溫程序條件進(jìn)行優(yōu)化，導(dǎo)致保藏后仍出現(xiàn)菌種退化和品質(zhì)下降[4，5]。本試驗(yàn)還對福建省食用菌種質(zhì)資源保藏中心的另外2個(gè)菌株Tr0007、Tr0013等進(jìn)行降溫程序、解凍溫度方面的液氮保藏試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，其保藏后的檢測結(jié)果（具體數(shù)據(jù)略）與本文試驗(yàn)菌株的表現(xiàn)規(guī)律相一致，只是在同一保藏條件下存在微小的菌株間的差異。

本研究結(jié)果表明，金福菇菌種經(jīng)程序降溫后的保藏效果比直接放進(jìn)液氮罐中好，萌發(fā)時(shí)間短，菌絲生長快且濃密。先從室溫以7 ℃/min降至4 ℃，再以1 ℃/min降至—40 ℃效果最好。金福菇菌種在保藏后還需要一定的溫度進(jìn)行解凍，以 35 ℃解凍后的菌株萌發(fā)時(shí)間較短，且生長速度較快，菌絲濃密。而影響金福菇菌種液氮保藏效果的因素還較多，如菌種的菌齡和培養(yǎng)基質(zhì)等，尚需要作進(jìn)一步的優(yōu)化研究。

［1]黃河，徐大雅.液氮保存疫霉屬菌種存活期檢測［J].真菌學(xué)報(bào)，1993，12（1）：48-53.

［2]Gerardo Mata， Rosalía Pérez-Merlo. Spawn viability in edible mushrooms after freezing in liquid nitrogen without a cryoprotectant［J]. Cryobiology， 2003， 47：14-20.

［3]劉新銳，葉夏，王玉青，宋秀高，陳傳明，謝寶貴.香菇菌種液氮保藏技術(shù)研究［J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（7）：1360-1363.

［4]曾輝，王澤生.食用菌菌種保藏研究進(jìn)展［J].中國食用菌，1994，13（5）：5-6.

［5]陳燕妍.超低溫凍結(jié)保藏?fù)?dān)子菌［J].真菌學(xué)報(bào)，1987，6（2）： 110-117.