蜂產(chǎn)品中吡咯里西啶生物堿分析方法研究進(jìn)展

■ 郭偉華，周金慧，黃京平，李熠*

（作者郭偉華、周金慧、黃京平、李熠單位為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所 農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（北京））

我國(guó)是世界最大的蜂產(chǎn)品生產(chǎn)國(guó)、出口國(guó)和消費(fèi)國(guó)。但由于我國(guó)食品安全管理和研究起步較晚，蜂產(chǎn)品出口屢次遭遇技術(shù)壁壘。2002年由于蜂蜜中禁用藥物氯霉素超標(biāo)，造成出口主要目的國(guó)的禁運(yùn)，并影響我國(guó)整個(gè)動(dòng)物源農(nóng)產(chǎn)品的出口。目前除了獸藥殘留及摻假外，吡咯里西啶生物堿作為蜂產(chǎn)品中一種新的危害因子已受到廣泛關(guān)注，成為潛在的技術(shù)壁壘指標(biāo)。

2009 年，阿根廷出口德國(guó)蜂蜜檢測(cè)出含有吡咯里西啶生物堿，嚴(yán)重打擊了阿根廷蜂蜜出口市場(chǎng)。2011年，歐盟食品安全局在對(duì)13,280份散裝蜂蜜、1324份零售蜂蜜樣本進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基礎(chǔ)上得出結(jié)論認(rèn)為，吡咯里西啶生物堿可能會(huì)對(duì)常喝蜂蜜的嬰兒以及兒童的健康構(gòu)成影響。據(jù)國(guó)外專家估計(jì)，中國(guó)蜂蜜市場(chǎng)約有10%的吡咯里西啶生物堿檢出水平，同時(shí)伴隨著國(guó)內(nèi)消費(fèi)量增加，蜂產(chǎn)品中吡咯西啶生物堿的食用安全性風(fēng)險(xiǎn)不容忽視。因此，蜂產(chǎn)品中吡咯里西啶生物堿的檢測(cè)分析方法將是質(zhì)量安全領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。

本文針對(duì)蜂產(chǎn)品中的吡咯里西啶生物堿的來(lái)源性質(zhì)，樣品前處理方法，檢測(cè)技術(shù)方法三方面進(jìn)行概述。

蜂產(chǎn)品中吡咯里西啶生物堿的來(lái)源性質(zhì)

1.蜂產(chǎn)品中吡咯里西啶生物堿的來(lái)源

生物堿是一類含氮堿性有機(jī)物，多數(shù)具有復(fù)雜的含氮雜環(huán)，有光學(xué)活性和顯著的生理效應(yīng)。吡咯里西啶生物堿（pyrrolizidine alkaloids，PAs）是生物堿中毒性較強(qiáng)一類，其來(lái)源于植物中的次生代謝產(chǎn)物，在植物學(xué)范疇及地理學(xué)范疇均有廣泛的分布，迄今為止，已從6000多種植物中分離發(fā)現(xiàn)了660種PA及其氮氧化衍生物，其中一半以上為有毒生物堿，這些植物95%以上集中于菊科、紫草科、豆科、蘭科之中。研究表明，產(chǎn)生吡咯里西啶生物堿植物的花粉中含有高濃度的PAs和（或）其N-氧化物。吡咯里西啶生物堿可以通過(guò)蜜蜂訪花時(shí)采集到花蜜和花粉而轉(zhuǎn)移到蜂蜜中。而中國(guó)特有的蜜源植物如向日葵屬于菊科，紫云英、苜蓿、苕子屬于豆科。因此我國(guó)向日葵蜜、紫云英蜜、苜蓿蜜以及苕子蜜等具有潛在的吡咯里西啶生物堿檢出可能。

2.吡咯里西啶生物堿的性質(zhì)

PAs的基本結(jié)構(gòu)為7-羥基-1-羥甲基6,7-雙氫-5H-吡咯里西啶即千里光次堿（nec ine）（圖1）。根據(jù)nec ine結(jié)構(gòu)，主要有兩種類型即倒千里光裂堿（retronecine）型和奧索千里光裂堿（otonecine）型，necine上的羥基被酯化，可分為單酯，開(kāi)鏈雙酯和大環(huán)雙酯。necine上的N可被氧化，形成相應(yīng)的N-氧化物，與PAs同時(shí)存在于植物體內(nèi)。

圖1 吡咯里西啶生物堿的主要結(jié)構(gòu)

PAs對(duì)動(dòng)物和人類有嚴(yán)重的毒性作用。其直接靶器官為肝臟，在體內(nèi)通過(guò)代謝活化而致毒，可引起肝細(xì)胞出血性壞死、肝巨紅細(xì)胞癥及靜脈閉塞癥等，所以又稱為肝毒吡咯里西啶生物堿。此外，還會(huì)引起肺臟、腎臟、神經(jīng)和胚胎毒性，致突變和致癌等。調(diào)查表明，在俄羅斯、印度、阿富汗、牙買加、南非、美國(guó)等地，許多肝病的發(fā)生與服用含PAs的草藥有關(guān)。分布廣泛的PAs可以通過(guò)間接的食物污染如谷物、牛奶、蜂蜜或牧草的污染或者直接通過(guò)含PAs的傳統(tǒng)草藥、滋補(bǔ)品、茶等對(duì)人類或牲畜生命造成極大的毒害。

目前，對(duì)各種含有PAs的藥物或食品的使用已引起世界上廣泛的重視。WHO早在1989年就頒布了吡咯里西啶生物堿健康與安全指南。許多國(guó)家都對(duì)PAs及其N-氧化物的使用量有所規(guī)定。如德國(guó)政府規(guī)定PAs及其N-氧化物的每日攝入量不得大于0.1 μg，孕婦及哺乳期婦女禁止服用。

吡咯里西啶生物堿因其對(duì)人類潛在的危害，引起了越來(lái)越多人員對(duì)其進(jìn)行定性和定量方法的研究探討，現(xiàn)將國(guó)內(nèi)外對(duì)其提取分離和檢測(cè)方法做一簡(jiǎn)要概述。

吡咯里西啶生物堿提取與分離

1.吡咯里西啶生物堿的提取

早期文獻(xiàn)中采用弱極性的溶劑從蜂蜜、牛奶和蛋類等基質(zhì)中提取PAs，但生物堿特別是其氮氧化物是極性化合物，在非極性溶劑中如二氯甲烷中溶解度不大，提取效率低。近幾年來(lái)提取一般選用極性較大的醇溶液如甲醇、乙醇等。蜂產(chǎn)品中一般采用水、甲醇或酸化水（如硫酸）提取。Keith betteridge等分別用甲醇和酸化水對(duì)蜂蜜進(jìn)行溶解進(jìn)而分析其中的PAs及其氮氧化物，結(jié)果表明，0.05 M 硫酸提取效果優(yōu)于甲醇。因PAs在酸性條件下以離子形式存在，水中加入少量酸可以提高生物堿水溶性，因而酸水的提取效率高于甲醇。

PAs的N-氧化物極性較大，不利于分析，因而在提取過(guò)程中或樣品純化后將其還原成游離的PAs。通常是采用鋅粉還原等方法或氧吸附樹(shù)脂法。Beales提出鋅粉的還原效率與時(shí)間有關(guān)，30 min～4 h最佳，過(guò)夜則還原效果不好。鋅粉的加入時(shí)間也有不同，Keith betteridge等在溶解蜂蜜后加入，Kerrier等在經(jīng)固相萃取分離純化樣品后加入。Kempf等分兩步將PAs還原，用鋅粉先將氮氧化物還原成PAs結(jié)構(gòu)，再用四氫化鋁鋰將PAs結(jié)構(gòu)還原為其necine結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)分析。

2.吡咯里西啶生物堿的分離

吡咯里西啶的分離有液液萃取法，固相萃取法等。液液萃取法的缺點(diǎn)是PAs及其氮氧化物不能同時(shí)被分離純化，操作過(guò)程煩瑣，溶劑量耗用較大，且萃取過(guò)程中極易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，PAs損失較多，因而漸漸被固相萃取法所取代，常用的固相萃取柱有C8、C18柱。上述方法的缺點(diǎn)在于共提物較多，在色譜分析中的背景干擾大，影響檢測(cè)的靈敏度和定量分析的準(zhǔn)確度。陽(yáng)離子交換柱對(duì)于生物堿的純化，是一種更為專屬的方法。它可以有效地去除干擾性雜質(zhì)，對(duì)PAs及其氮氧化物均有良好的純化效果并且不受其它共流出物的干擾。而且不同填料的SCX固相萃取柱提取分離的回收率不同，硅膠鍵和苯磺酸填料的萃取柱提取效果比較好。另外，洗脫液的比例也影響提取效率。Mroezek等考察了洗脫液對(duì)PAs及其氮氧化物的影響。分別用10%氨水：甲醇體積比為l:3和2:3，以及25%氨水：甲醇（ 1:8）洗脫出生物堿。結(jié)果表明10%氨水：甲醇 （1:3）洗脫效果最佳，回收率在70%以上。

蜂產(chǎn)品中一般采用SCX固相萃取柱凈化雜質(zhì)，如Caroline先將蜂蜜樣品在水浴鍋中均質(zhì)化離心后，上清液置于預(yù)先活化的SCX柱中，氨化甲醇洗脫，回收率為87%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.42%。Beuerle采用不同的蜂蜜前處理方法。將蜂蜜樣品液液萃取后在線固相萃取和QuEChERS法進(jìn)行純化，兩種方法均得到了良好的效果。

吡咯里西啶生物堿的檢測(cè)分析

吡咯里西啶生物堿檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法以及近幾年發(fā)展起來(lái)的氣質(zhì)和液質(zhì)等聯(lián)用技術(shù)，核磁共振和免疫學(xué)方法等。

早期的PAs檢測(cè)采用薄層色譜法和氣相色譜法，薄層色譜法選用的顯色劑為常用的生物堿顯色劑如Dragendorf’s試劑（ 碘化鉍鉀試液）等。但這類試劑的專屬性不強(qiáng)。選用氣相色譜法對(duì)PAs進(jìn)行定量分析時(shí)，檢測(cè)器以火焰離子化檢測(cè)器最常用，但由于PAs高溫易分解，常需要衍生化，步驟繁瑣。氣相色譜法與其它分析技術(shù)聯(lián)用，如質(zhì)譜、紅外等，已越來(lái)越多運(yùn)用于PAs的分析鑒定。尤其是與質(zhì)譜的聯(lián)用。在前者良好分離的基礎(chǔ)上，質(zhì)譜檢測(cè)，不僅可以鑒別和定量分析植物中的PAs，還可提供未知PAs的分子量及結(jié)構(gòu)信息。

1.氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法

Michael Kempf運(yùn)用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和和參數(shù)方法來(lái)對(duì)216個(gè)市售蜂蜜樣品和500個(gè)蜂花粉樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，實(shí)驗(yàn)將樣品經(jīng)鋅粉和四氫化鋁鋰兩次還原為necin母核進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，用N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA）衍生化。結(jié)果顯示，19個(gè)樣品檢測(cè)為陽(yáng)性，含量范圍為0.019～0.120 μg/g，定量限0.01 ppm。此方法無(wú)需鑒定出每種吡咯里西啶的種類因而促進(jìn)了PAs選擇性鑒定研究。但此方法不能夠檢測(cè)otonecine型PAs。并且對(duì)蜂蜜和花粉的分析表明PAs含量高的蜂蜜與其對(duì)應(yīng)的花粉含量之間沒(méi)有明顯線性關(guān)系。

利用氣相色譜方法研究 PAs時(shí)存在衍生化煩瑣，化合物不穩(wěn)定且耗時(shí)等因素，加之PAs在紫外檢測(cè)器的局限，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在儀器，接口和數(shù)據(jù)處理設(shè)計(jì)上的先進(jìn)性促使研究人員逐步探索開(kāi)發(fā)適合于PAs分析的高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。

2.液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)法

Caroline T.Griffin采用液相色譜串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜（LC-MS/M S）分析了不同地區(qū)零售蜂蜜中的吡咯里西啶的種類和含量。方法呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2> 0.991），檢測(cè)限和定量限分別為0.0134～0.0305，0.0446～0.1018 μg mL-1，回收率87%。但其標(biāo)品中沒(méi)有吡咯里西啶生物堿的氮氧化物標(biāo)品因此測(cè)出的含量比實(shí)際要偏低。

Michael等采用HPLC-ESI-MS對(duì)藍(lán)薊蜂花粉中的吡咯里西啶生物堿進(jìn)行分析，結(jié)果表明，藍(lán)薊花粉中的吡咯里西啶生物堿主要是氮氧化物型，并且為證明花粉是其對(duì)應(yīng)蜂蜜中吡咯里西啶發(fā)生物堿的潛在來(lái)源提供了依據(jù)。

Beuerle通過(guò)對(duì)HRGC-EI-MS （SIM）和LC -ESI - MS/MS兩種使用較多的方法進(jìn)行比較，采用前一種方法時(shí)，樣品用硫酸溶解，經(jīng)過(guò)鋅粉和四氫化鋁鋰兩次還原，SCX提取凈化，MSTFA衍生，GC - EI - SIM /MS分析。第二種方法的過(guò)程為加水溶解，加入QuECHERS鹽和乙腈提取用LC -ESI - MS/MS分析。結(jié)果顯示，GC - MS方法的優(yōu)點(diǎn)是，能夠檢出較多的PAs,能應(yīng)用到不同的樣品和背景，不需要樣品或相關(guān)PAs的背景資料，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的依賴低；缺點(diǎn)是otonecine型PAs不能被檢出，PAs結(jié)構(gòu)信息丟失，需要氮氧化物的還原，耗時(shí)長(zhǎng)。LC-MS/MS優(yōu)點(diǎn)是能夠同時(shí)檢測(cè)PA及其氮氧化物，可獲得不同PAs的結(jié)構(gòu)信息，耗時(shí)短，缺點(diǎn)是會(huì)丟失一部分PAs信息，定量定性依賴于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

3.其他方法

核磁共振主要用于吡咯里西啶生物堿的定性分析，免疫學(xué)分析如競(jìng)爭(zhēng)性酶聯(lián)免疫也在分析吡咯里西啶生物堿中得到應(yīng)用，Bober MA等通過(guò)已被生產(chǎn)出來(lái)的倒千里光裂堿（retronecine）和野百合堿（monocrotaline）的抗體并采用親和素-生物素抗體酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行測(cè)定。

討論

目前已報(bào)道的方法中還沒(méi)有能夠?qū)⒆匀唤缰兴锌赡艽嬖诘腜As進(jìn)行分析鑒定。因此，應(yīng)優(yōu)化提取分離和分析條件來(lái)建立適用于多類生物堿同時(shí)分析測(cè)定的方法。

雖然色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)在分析領(lǐng)域已經(jīng)趨于成熟，但是其他分析方法及相關(guān)輔助技術(shù)尚有很大提高空間。國(guó)內(nèi)外某些先進(jìn)的前處理技術(shù)和儀器分析手段如：在線固相萃取、加速溶劑提取，基于碳納米管的固相萃取、在線衍生化、二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析法、超臨界流體色譜分析法、免疫親和色譜法等技術(shù)均有應(yīng)用在農(nóng)產(chǎn)品中生物堿分析上的報(bào)道，值得借鑒到在蜂產(chǎn)品的分析當(dāng)中來(lái)。高效、快速、低能耗、污染少、多組分分析是未來(lái)蜂產(chǎn)品中吡咯里西啶檢測(cè)方法發(fā)展方向。

蜂產(chǎn)品中的吡咯里西啶生物堿在很多國(guó)家都有檢出報(bào)道。Dübecke采用LC-MS/MS方法對(duì)3917個(gè)蜂蜜樣品和119個(gè)花粉樣品進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)表明，66%的原蜜樣品和94%的零售蜂蜜含有PAs，60%的花粉樣品檢測(cè)為陽(yáng)性。PA類型可以用來(lái)鑒別蜂蜜中的PAs潛在來(lái)源并已在藍(lán)薊屬植物的花粉分析中進(jìn)行了驗(yàn)證。由于中國(guó)出口的蜂蜜種類有限，目前除了臺(tái)灣的蜂蜜檢出蜜源植物霍香的生物堿成分外，還沒(méi)有對(duì)我國(guó)產(chǎn)蜂蜜中生物堿的檢出報(bào)道。我國(guó)蜜源植物種類眾多，亟需對(duì)蜂產(chǎn)品中吡咯里西啶生物堿開(kāi)展全面的分析研究。