補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清對(duì)缺氧性神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響

趙舒武 蔡 青 王曉玲 薛 亮

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 300193）

神經(jīng)干細(xì)胞可自我更新，并可分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，與神經(jīng)損傷后的修復(fù)和退行性疾病的治療密切相關(guān)。在神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病時(shí)，神經(jīng)組織中的神經(jīng)干細(xì)胞也會(huì)受到嚴(yán)重影響。因此，在神經(jīng)損傷或退行性變時(shí)如何保護(hù)其內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞免受或減緩損傷，成為一個(gè)重要的研究課題。缺氧缺血性腦損傷是最常見(jiàn)的一類神經(jīng)損傷，是多年來(lái)神經(jīng)科學(xué)中的一個(gè)研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯是中醫(yī)治療腦卒中的經(jīng)典名方，臨床療效顯著。近年來(lái)，陸續(xù)有人在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺氧缺血性腦損傷有神經(jīng)保護(hù)作用，但對(duì)其作用點(diǎn)和作用機(jī)制尚不得而知[1-3]。本實(shí)驗(yàn)利用體外神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法，單因素的檢測(cè)補(bǔ)陽(yáng)還五湯動(dòng)物血清對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞缺氧性損傷的保護(hù)作用，并觀察其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 孕14d成年未經(jīng)產(chǎn)Wistar大鼠；（300±15）g，6～8周齡清潔級(jí)Wister大鼠，雌雄各半。購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：scxk2005-0001。

1.2 試劑 DMEM/F12（1∶1），B27（Invitrogen），堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）和多聚賴氨酸（Sigma），胎牛血清（FBS，杭州四季青生物技術(shù)有限公司），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）（Sigma產(chǎn)品）， 兔抗人神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE），多克隆抗體、兔抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白 （GFAP）多克隆抗體PowerVisionTM免疫組化試劑盒和DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥物（生黃芪120g、當(dāng)歸尾6g、赤芍5g、地龍3g、川芎3g、紅花3g、桃仁3g）來(lái)自天津中新藥業(yè)。

1.3 補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清制備 取清潔級(jí)Wister大鼠，雌雄各半，根據(jù)人和動(dòng)物體表面積的等效劑量表計(jì)算，相當(dāng)于臨床等效劑量，藥物濃度0.6g/mL。藥物組大鼠給藥劑量1mL/100g，早晚各 1次，連續(xù)給藥 3d，第 4日早晨 1次灌服全天劑量。2h后采血。對(duì)照組大鼠給等量生理鹽水，以獲得對(duì)照血清。無(wú)菌條件右心房取血，離心管靜置6h，取析出血清，1000r/min離心 10min， 收集上清，56℃滅活 30min，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定 取孕齡14d的大鼠，頸椎脫臼處死后75%乙醇浸泡消毒3min，無(wú)菌條件下取出胎鼠，取大腦皮質(zhì)并小心剝離軟腦膜，冷D-Hank’s漂洗后，用1mL移液槍吹打，機(jī)械分散，細(xì)胞懸液過(guò)75μm篩網(wǎng)，1000r/min離心，棄上清，全培基（2%B27，20μg/L bFGF 的 DMEM/F12）重懸，CO2培養(yǎng)箱中懸浮培養(yǎng)，每3d半量換液，期間每天補(bǔ)加10μg/L bFGF。生長(zhǎng)6d后，收集培養(yǎng)的神經(jīng)球傳代，通過(guò)acutase酶消化和5號(hào)注射器機(jī)械分散，使之呈單細(xì)胞懸液，進(jìn)行傳代。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)狀況。實(shí)驗(yàn)用穩(wěn)定生長(zhǎng)的第3代懸浮神經(jīng)球。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組 取3代神經(jīng)干細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，將載藥血清和對(duì)照血清用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋成5%、10%、20%三個(gè)濃度梯度，將神經(jīng)干細(xì)胞懸液放入5%CO2、5%O2、飽和濕度的37℃三氣培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)定相應(yīng)常規(guī)培養(yǎng)箱對(duì)照組。每組均設(shè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.3.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的活性 將各組細(xì)胞以每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積150μL，按照預(yù)設(shè)條件干預(yù)并分別于缺氧0.5h、2h、24h測(cè)定OD值。

1.4.3.2 NSE和GFAP的免疫細(xì)胞化學(xué)染色及計(jì)數(shù) 將各組細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中 （預(yù)先置涂有多聚賴氨酸的蓋玻片），每孔平均接種50個(gè)球，靜置培養(yǎng)，每3天換液。10d后收集貼有細(xì)胞的蓋玻片，分別做NSE、GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色（采用PV二步法）。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取100個(gè)視野，普通光鏡下觀察并計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分率，取平均值。

1.4.3.3 分化細(xì)胞的顯微測(cè)量 將載藥血清和對(duì)照血清各組于37℃、5%CO2條件下靜置培養(yǎng)，每3天常規(guī)換液。分別于接種后5d、7d每孔隨機(jī)取10個(gè)視野測(cè)量細(xì)胞突起長(zhǎng)度。突起長(zhǎng)度測(cè)量時(shí)取最長(zhǎng)突起，長(zhǎng)度取其平均值（μm）。所測(cè)細(xì)胞均有暈光。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 MTT檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)表1。各濃度組載藥血清對(duì)缺氧神經(jīng)干細(xì)胞均具一定保護(hù)作用，最佳干預(yù)濃度為10%補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清，而5%和20%干預(yù)濃度不顯著。

2.2 細(xì)胞分化比例檢測(cè) 免疫組化染色及計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，分化培養(yǎng)5d時(shí)，各濃度載藥血清組NSE和GFAP免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著多于相應(yīng)的對(duì)照組，10%濃度組比例要高于其他2個(gè)濃度組，見(jiàn)表2、表3。

2.3 細(xì)胞突起長(zhǎng)度顯微測(cè)量結(jié)果 缺氧對(duì)照血清組神經(jīng)球貼壁率低，可見(jiàn)許多細(xì)胞團(tuán)漂浮在培養(yǎng)基中，最終漂浮的細(xì)胞團(tuán)變?yōu)榧?xì)胞碎片（圖1-C）。缺氧載藥血清各實(shí)驗(yàn)組中，部分神經(jīng)球貼壁困難，一旦神經(jīng)球貼壁，隨即有突起長(zhǎng)出，胞體和突起生長(zhǎng)較快，可見(jiàn)雙突起和多突起細(xì)胞；第2日即可見(jiàn)部分細(xì)胞建立突觸聯(lián)系；第4日多數(shù)細(xì)胞可形成較密集網(wǎng)絡(luò)，胞體較豐滿，細(xì)胞突起生長(zhǎng)快，可見(jiàn)多角形細(xì)胞（圖1-A、B）。缺氧對(duì)照血清組細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)稀疏，細(xì)胞胞體較小，突起變短、變粗，有的胞體內(nèi)可見(jiàn)空泡（圖1-D）。顯微測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

補(bǔ)陽(yáng)還五湯具有補(bǔ)氣活血、通經(jīng)活絡(luò)的作用，是中醫(yī)藥治療腦卒中的經(jīng)典方劑，其臨床療效顯著。動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦缺血灶具有顯著神經(jīng)保護(hù)作用，并且發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯能促進(jìn)并維持大鼠局灶性腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，作用機(jī)制不明[4-5]。復(fù)方中藥多經(jīng)口服發(fā)揮治療作用，其成分復(fù)雜，在體內(nèi)或轉(zhuǎn)化成有效成分，或代謝失活。有人曾用中藥的粗提取物用于體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，但因其成分復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以正確判斷，且常常難以融入細(xì)胞培養(yǎng)基。動(dòng)物灌服中藥后，提取血清用于體外實(shí)驗(yàn)是日本學(xué)者Hiriko Iwama首先提出并采用的。該方法不僅可以反映藥物中可吸收部分的直接作用，也可以反映藥物在機(jī)體內(nèi)形成代謝產(chǎn)物和藥物誘生的機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)，因此血清中含有經(jīng)體內(nèi)代謝和生物轉(zhuǎn)化的綜合有效成分，并且排除了粗制劑中非有效成分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，比較真實(shí)反映中藥的藥效和作用[6]。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究不同濃度補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清對(duì)缺氧環(huán)境中體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響。

表1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清對(duì)各組細(xì)胞OD的影響（）

表1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清對(duì)各組細(xì)胞OD的影響（）

注：與正常對(duì)照組比較，□P＜0.05；與缺氧對(duì)照組比較，▲P＜0.05；與缺氧對(duì)照血清組1比較，*P＜0.05；與缺氧對(duì)照血清組2比較，#P＜0.05；與缺氧對(duì)照血清組 3 比較，△P＜0.05。

表2 對(duì)缺氧神經(jīng)干細(xì)胞分化為NSE陽(yáng)性細(xì)胞的影響（） %

表2 對(duì)缺氧神經(jīng)干細(xì)胞分化為NSE陽(yáng)性細(xì)胞的影響（） %

注：與同組5%血清濃度組比較，□P＜0.05；與同組20%血清濃度組比較，▲P＜0.05。

表3 對(duì)缺氧神經(jīng)干細(xì)胞分化為GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的影響（） %

表3 對(duì)缺氧神經(jīng)干細(xì)胞分化為GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的影響（） %

注：與同組5%血清濃度組比較，□P＜0.05；與20%血清濃度組比較，▲P＜0.05。

表4 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺氧干預(yù)細(xì)胞突起長(zhǎng)度的影響（） μm

表4 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺氧干預(yù)細(xì)胞突起長(zhǎng)度的影響（） μm

注：與相應(yīng)天數(shù)相應(yīng)濃度對(duì)照血清組比較，*P＜0.01。

圖1 各組鏡下神經(jīng)球細(xì)胞圖片

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清可改善缺氧神經(jīng)干細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，各載藥血清濃度中，10%濃度組明顯優(yōu)于其他干預(yù)濃度組，說(shuō)明補(bǔ)陽(yáng)還五湯能起到保護(hù)和減緩神經(jīng)干細(xì)胞缺氧性損傷的作用，10%濃度組作用效果最為明顯。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯亦可促進(jìn)缺氧神經(jīng)干細(xì)胞的分化。免疫組化染色并計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，藥物血清組中NSE及GFAP陽(yáng)性細(xì)胞均多于對(duì)照血清組，即表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清亦可促進(jìn)缺氧環(huán)境下神經(jīng)干細(xì)胞的分化。經(jīng)顯微測(cè)量顯示，缺氧載藥血清各濃度組細(xì)胞突起明顯長(zhǎng)于相應(yīng)的缺氧對(duì)照血清組。倒置相差顯微鏡下觀察也發(fā)現(xiàn)，載藥血清組神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)育完善，神經(jīng)元的胞體更加豐滿，胞體較大，突起較長(zhǎng)，其突起明顯長(zhǎng)于對(duì)照血清組，細(xì)胞之間可形成較密集的網(wǎng)絡(luò)。提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯還可促進(jìn)分化細(xì)胞突起的生長(zhǎng)和細(xì)胞進(jìn)一步成熟，對(duì)細(xì)胞具有營(yíng)養(yǎng)作用?？傊?，本實(shí)驗(yàn)提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清可促進(jìn)缺氧環(huán)境下神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，并且有利于分化細(xì)胞的進(jìn)一步成熟，尤以10%載藥血清組效果最顯著，與文獻(xiàn)研究結(jié)果相符。但補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)缺氧環(huán)境中神經(jīng)干細(xì)胞的保護(hù)作用是如何實(shí)現(xiàn)的，其具體作用機(jī)制仍未可知。本實(shí)驗(yàn)中我們篩選了補(bǔ)陽(yáng)還五湯載藥血清的最佳干預(yù)濃度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將以此為基礎(chǔ)從信號(hào)通路水平深入探討該方的作用機(jī)制。

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