革蘭陰性桿菌產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶及其耐藥分子機(jī)制的研究

馮體玉，徐韞健，李 寧，余 琳

（1.梅州市人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 梅州514031；2.廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 廣州510120）

青霉素和頭孢菌素等β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物在長期使用中，細(xì)菌逐漸對(duì)其產(chǎn)生抗藥性。β－內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是革蘭陰性桿菌對(duì)該類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制之一，臨床上的β－內(nèi)酰胺酶主要是ESBLs、AmpC酶和MBL。目前，β－內(nèi)酰胺酶的傳播機(jī)制仍不是很明確，質(zhì)粒攜帶的β－內(nèi)酰胺酶耐藥基因在質(zhì)粒間及質(zhì)粒與染色體間轉(zhuǎn)移可能是通過轉(zhuǎn)座子或插入序列為工具實(shí)現(xiàn)的［1］。本文對(duì)173株革蘭陰性桿菌進(jìn)行可疑產(chǎn)酶株篩選，鑒定其基因型，并對(duì)β－內(nèi)酰胺酶周圍的“基因環(huán)境”進(jìn)行了分析，進(jìn)而對(duì)基因元件整合子、轉(zhuǎn)座子、插入序列與革蘭陰性桿菌耐藥的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 菌株 2010年4月－2010年12月，梅州市人民醫(yī)院和廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科分離的173株（無重復(fù)）革蘭陰性桿菌，大腸埃希菌38株，肺炎克雷伯菌32株，鮑曼不動(dòng)桿菌30株，銅綠假單胞菌27株，陰溝腸桿菌20株，洋蔥假單胞菌10株，弗勞地枸櫞酸桿菌8株，摩根摩根菌8株。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌 ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603和銅綠假單胞菌ATCC27853均購自衛(wèi)生部藥品鑒定所。

1.2 主要試劑與儀器 K－B法藥敏紙片購自英國OXID公司，Taq酶、dNTPs、DL2000標(biāo)志物均購自日本 TaKaRa公 司，VITEK－2GNP藥敏卡和VITEK－2全自動(dòng)微生物鑒定儀購自法國生物梅里埃公司，PCR擴(kuò)增儀購自美國Bio－Rad公司，超聲細(xì)胞粉碎儀購自寧波新芝公司，超高離心機(jī)購自美國Beckman公司。

1.3 PCR引物 均由上海英俊生物公司合成，根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)如表1。

表1 PCR引物序列表

1.4 細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)用K－B藥敏試驗(yàn)和VITEK－2GNP藥敏卡進(jìn)行，結(jié)果判定按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2010制定的規(guī)則及標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行［2］。

1.5 三維試驗(yàn) 將大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922按K－B法涂布在MH平板上。在平板的中央貼一張頭孢西丁紙片，從距離紙片5mm處用無菌刀片在平板的瓊脂上向外切一裂隙。每一裂隙中加入30μl的一種待測菌株的β－內(nèi)酰胺酶粗提物。35℃培養(yǎng)24h，觀察裂隙的內(nèi)測端（頭孢西丁紙片的抑菌環(huán)內(nèi)）周圍有無細(xì)菌生長。判斷標(biāo)準(zhǔn)：裂隙的內(nèi)測端周圍有細(xì)菌生長、導(dǎo)致頭孢西丁紙片的抑菌環(huán)有缺失者為陽性。

1.6 ESBLs表型檢測 按2010年CLSI推薦的紙片擴(kuò)散法ESBLs實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行，以肺炎克雷伯菌ATCC700603為質(zhì)控菌株跟隨試驗(yàn)。初篩法：0.5麥?zhǔn)蠞岫染壕鶆蛲磕ㄓ贛H平板，貼上紙片頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟、氨曲南，于35℃溫箱中放置18－24h后觀察結(jié)果。當(dāng)受試菌對(duì)頭孢他啶（30μg／片）紙片的抑菌環(huán)直徑≤22mm、氨曲南（30 μg／片）紙片的抑菌環(huán)直徑≤27mm、頭孢噻肟 （30 μg／片）紙片的抑菌環(huán)直徑 ≤27mm或頭孢曲松（30 μg／片）紙片的抑菌環(huán)直徑≤25mm，只要有一種可視為疑產(chǎn)ESBLs菌株。

確證法：對(duì)初篩陽性菌株，采用頭孢他啶（30 μg／片）、頭孢他啶／克拉維酸（30μg／10μg／片）、頭孢噻肟（30μg／片）、頭孢噻肟／克拉維酸（30μg／10 μg／片）檢測，一對(duì)紙片間相距2 5mm，于35℃溫箱中放置18－24h后觀察結(jié)果。任一組藥物的抑菌環(huán)直徑相差≥5mm，判定為ESBLs陽性菌株。

1.7 紙片協(xié)同試驗(yàn)檢測金屬酶 0.5麥?zhǔn)蠁挝淮郎y菌菌液均勻涂布MH瓊脂平板，中間貼10μg亞胺培南和30μg頭孢他啶紙片，距紙片1.5－2.5cm處貼一空白紙片，加2－3μl 2－巰基乙醇原液。35℃培養(yǎng)過夜，如靠近2－巰基乙醇側(cè)亞胺培南和頭孢他啶抑菌環(huán)有擴(kuò)大者為產(chǎn)金屬酶菌株。

1.8 PCR擴(kuò)增目的基因 用加熱裂解法制備DNA模板。反應(yīng)體系總體積20μl，其中正反引物各1μl，10×PCR緩沖液2μl，dNTP及Taq酶各1 μl，DNA模板2μl。反應(yīng)條件為除退火溫度不同外，95℃預(yù)變性3min，95℃30s，56℃35s，72℃45s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海英俊生物公司測序，結(jié)果在GenBank中經(jīng)BLAST分析以確定其基因型別。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 WHONET5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析革蘭陰性桿菌的耐藥率。

2 結(jié)果

2.1 β－內(nèi)酰胺酶表型檢出率 革蘭陰性桿菌β－內(nèi)酰胺酶的總檢出率為24.28%（42／173），主要由單產(chǎn)ESBLs引起，檢出率為13.29%；其次為產(chǎn)ESBLs＋AmpC引起，檢出率為6.36%，見表2。

表2 42株革蘭陰性桿菌株產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶表型檢出率（%）

2.2 β－內(nèi)酰胺酶基因型檢出率 革蘭陰性桿菌β－內(nèi)酰胺酶基因的總檢出率為24.86%（43／173），TEM、SHV、CTX－M－G1、PSE、ACT－1、DHA－1、CMY及IMP－1總陽性率在臨床分離的革蘭陰性桿菌中分別為：24.86%、8.09%、11.56%、1.16%、2.89%、5.20%、4.62%及0.58%。大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單孢菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、陰溝腸桿菌、洋蔥假單胞菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、摩根摩根菌都攜帶5－7種β－內(nèi)酰胺酶基因，見表3。

表3 β－內(nèi)酰胺酶在革蘭陰性菌屬中基因型的分布

2.3 基因元件在革蘭氏陰性菌屬中的分布 整合子、插入序列ISEcp1B和轉(zhuǎn)座子tnpU在173株革蘭氏陰性菌屬中檢出率分別為28.32%，16.76%，16.18%，在各菌屬中的分布見表4，基因元件陽性的菌株大多數(shù)β－內(nèi)酰胺酶表型為陽性。

2.4 β－內(nèi)酰胺酶陽性與陰性菌株藥敏結(jié)果比較從173株革蘭陰性桿菌藥敏結(jié)果中，42株β－內(nèi)酰胺酶陽性菌株對(duì)氨芐西林、頭孢曲松、頭孢唑啉均耐藥；對(duì)丁胺卡那霉素、亞胺培南敏感率最高，見表5。42株β－內(nèi)酰胺酶陽性菌株對(duì)抗生素的耐藥性顯著高于陰性菌株，P＜0.05。

表4 基因元件在革蘭陰性菌屬中的分布（株）

表5 β－內(nèi)酰胺酶陽性和陰性菌株對(duì)15種抗菌藥物敏感率的比較

3 討論

臨床上ESBLs、AmpC酶最為常見，這與本研究表2中β－內(nèi)酰胺酶表型和表3中β－內(nèi)酰胺酶基因分型結(jié)果相符。產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶多重耐藥革蘭陰性桿菌基因的總檢出率為24.86%，略低于表型試驗(yàn)24.28%，其中有3株菌檢出β－內(nèi)酰胺酶基因，但表型為陰性；有2株菌的β－內(nèi)酰胺酶表型為陽性，但實(shí)驗(yàn)所檢的基因都為陰性?？赡苁窃O(shè)計(jì)引物不能測出菌株攜帶的基因型，或者菌株雖攜帶基因但不表達(dá)β－內(nèi)酰胺酶。研究結(jié)果顯示，所分離出的革蘭陰性桿菌中，產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶最常見的菌種是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單孢菌及鮑曼不動(dòng)桿菌。其他革蘭陰性桿菌如陰溝腸桿菌、洋蔥假單胞菌、弗勞地枸櫞酸桿菌、摩根摩根菌也檢出β－內(nèi)酰胺酶，說明攜帶β－內(nèi)酰胺酶耐藥的基因在不同種類的菌屬中進(jìn)行了廣泛轉(zhuǎn)移。本研究中的產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶的菌株對(duì)許多β－內(nèi)酰胺類的抗菌藥物以及其他抗菌藥物呈多重耐藥，給臨床抗感染構(gòu)成嚴(yán)重威脅，其中對(duì)氨芐西林、頭孢曲松、頭孢唑啉均耐藥，對(duì)丁胺卡那霉素、亞胺培南敏感率最高，對(duì)抗生素的耐藥性顯著高于不產(chǎn)酶菌株。

近年來通過對(duì)β－內(nèi)酰胺酶周圍的“基因環(huán)境”進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：質(zhì)粒攜帶的β－內(nèi)酰胺酶耐藥基因在質(zhì)粒間及質(zhì)粒與染色體間轉(zhuǎn)移主要是通過轉(zhuǎn)座子或插入序列為工具實(shí)現(xiàn)的。質(zhì)粒通過接合作用、整合子通過整合酶俘獲耐藥基因，通過共用的啟動(dòng)子進(jìn)行表達(dá)的研究已有大量的報(bào)道［3，4］。本研究中基因元件陽性的菌株大多數(shù)β－內(nèi)酰胺酶表型為陽性，大量文獻(xiàn)也報(bào)道基因元件可介導(dǎo)病原菌各種耐藥基因［5］，獲得基因元件的病原菌可表現(xiàn)為多重耐藥。這也是本研究中的產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶的菌株對(duì)抗生素的耐藥性顯著高于不產(chǎn)酶菌株的另一個(gè)原因。整合子是可移動(dòng)的基因元件，可攜帶多種內(nèi)酰胺酶和氨基糖苷類修飾酶基因，在同種和不同種細(xì)菌中進(jìn)行基因的水平轉(zhuǎn)移，從而使細(xì)菌的耐藥性得以快速傳播。本研究檢測的是Ⅰ類整合子，在大多數(shù)革蘭陰性桿菌中均可檢出，與文獻(xiàn)報(bào)道的有所不同［6］，這可能與研究的菌株數(shù)量和種屬不同有關(guān)。插入序列ISEcp1B長度1，655bp，其轉(zhuǎn)座酶能夠識(shí)別反向重復(fù)序列，并催化轉(zhuǎn)座因子發(fā)生刪除作用。文獻(xiàn)報(bào)道［7，8］在CTX－M基因的側(cè)翼發(fā)現(xiàn)有插入序列ISEcplB，參與耐藥基因從染色體到質(zhì)粒的播散。本研究對(duì)ISEcp1BPCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)大部分ISEcp1B的右端均連接一個(gè)反向重復(fù)序列，為轉(zhuǎn)位酶提供作用位點(diǎn)，下游均連接CTX－M型ESBLs基因，為其水平轉(zhuǎn)移提供作用識(shí)別位點(diǎn)；并提供－35及－10兩個(gè)啟動(dòng)子，對(duì)下游CTX－M型ESBLs的高水平表達(dá)和傳播起重要的調(diào)控作用。轉(zhuǎn)座子是指能將自身插入基因組中一個(gè)在序列上無關(guān)的新位點(diǎn)的DNA序列，位于β－內(nèi)酰胺酶基因的兩側(cè)，很容易攜帶著抗生素抗性基因從細(xì)菌染色體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒或噬菌體基因組上，使細(xì)菌基因具有重組和重排的潛力。本研究的革蘭陰性菌其tnpU基因陽性檢出率為16.18%，較其它文獻(xiàn)報(bào)道率低［9，10］?？赡苁怯捎诟腥揪昙凹?xì)菌的耐藥特性各不相同有關(guān)。轉(zhuǎn)座子tnpU基因在大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌和銅綠假單胞菌中均有檢出，在非發(fā)酵菌中的檢出率相對(duì)較高?；蛟献印⒉迦胄蛄泻娃D(zhuǎn)座子基因元件廣泛分布于革蘭陰性桿菌中，其俘獲及啟動(dòng)β－內(nèi)酰胺酶表達(dá)的能力，可能在多重耐藥機(jī)制中起重要作用。

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