血清MMP－13及TIMP－1檢測(cè)對(duì)原發(fā)性肝癌的早期診斷價(jià)值

張建忠，朱建云，包海燕，邵玲玲，徐 燃，錢(qián)引坤，黃書(shū)明

（1.如東縣人民醫(yī)院，江蘇 如東226400；2.南通市第三人民醫(yī)院，江蘇 南通226001）

肝癌是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，早期診斷及治療對(duì)其預(yù)后具有重要意義。傳統(tǒng)血清診斷標(biāo)志物AFP及γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶同工酶Ⅱ（GGT－Ⅱ）雖有較好的敏感性，但仍存在一定的假陽(yáng)性［1］，故尋找新的肝癌早期診斷標(biāo)志物具有重要臨床意義?；|(zhì)金屬蛋白酶－13（MMP－13）及其天然抑制劑基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子－1（TIMP－1）的表達(dá)存在明顯的相關(guān)性，其與肝病的關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)［2］，本文采用ELISA法檢測(cè)慢性肝炎、肝硬化以及原發(fā)性肝癌（PHC）患者血清中 MMP－13、TIMP－1水平，探討其對(duì)早期肝癌的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年1月－2011年12月南通市第三人民醫(yī)院住院肝病患者共198例，其中慢性肝炎患者66例，男性42例，女性24例，年齡25－68歲；肝硬化患者76例，男性53例，女性23例，年齡26－69歲；原發(fā)性肝癌患者56例（TNM分期［3］：Ⅰ期14例，Ⅱ期16例，Ⅲ期13例，Ⅳ期13例），男性43例，女性13例，年齡30－66歲。慢性肝炎、肝硬化的診斷符合2000年9月中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)于西安聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》的標(biāo)準(zhǔn)［4］，原發(fā)性肝癌的診斷符合2001年9月中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專(zhuān)業(yè)委員會(huì)修訂的《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》［5］。所有病例HBsAg陽(yáng)性并持續(xù)6個(gè)月以上，無(wú)合并甲、丙、丁、戊型等其他病毒性肝炎，無(wú)酒精性、藥物性、自身免疫性或代謝性肝病，均除外其他 MIMP－13、TIMP－1增高的因素，如腫瘤、肺纖維化等。對(duì)照組60例為我院體檢健康者（既往無(wú)肝病史，近期肝腎功能及腹部B超檢查均為正常，血清 HBV標(biāo)志物陰性），男性32例，女性28例，年齡26－68歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 清晨空腹采集靜脈血3ml，室溫靜置分離血清后置－80℃冰箱保存。

1.2.2 血清 MMP－13、TIMP－1測(cè)定 按試劑盒說(shuō)明書(shū)ELISA法檢測(cè)血清 MMP－13、TIMP－1（武漢博士德生物工程有限公司）含量。

1.2.3 血清AFP測(cè)定 采用化學(xué)發(fā)光法，儀器與試劑為美國(guó)雅培i2000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀及其配套試劑。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SigmaPlot 12.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料經(jīng)Kolmogorov檢驗(yàn)符合正態(tài)分布并以（±s）表示，單因素方差分析比較各組間差異；率的比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)理論頻數(shù)小于5時(shí)，采用Fisher確切概率法；Pearson相關(guān)分析各指標(biāo)間相關(guān)性，ROC曲線確定各指標(biāo)診斷界值。

2 結(jié)果

2.1 各組血清中 MMP－13、TIMP－1檢測(cè)結(jié)果

MMP－13、TIMP－1在各組中水平依次為：原發(fā)性肝癌組＞肝硬化組＞慢性肝炎組＞健康對(duì)照組，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。原發(fā)性肝癌組TIMP－1／MMP－13的比值小于肝硬化組的比值（表1）。

表1 血清 MMP－13、TIMP－1水平在各組間的比較

2.2 ROC曲線分析 MMP－13、TIMP－1對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值

根據(jù)ROC曲線（圖1），確定 MMP－13（曲線下面積＝0.93）及TIMP－1（曲線下面積＝0.88）對(duì)良、惡性肝病的診斷界值分別為326μg／L及196.5 μg／L。以此為診斷界值，MMP－13及 TIMP－1對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷敏感性、特異性分別為86%、82%及79%、84%。兩者平行聯(lián)合試驗(yàn)的敏感性、特異性分別為97%及69%，系列聯(lián)合試驗(yàn)的敏感性、特異性分別為68%及97%（表2）。

2.3 MMP－13、TIMP－1對(duì)微小肝癌及不同 AFP水平肝癌的診斷價(jià)值

圖1 血清MMP－13和TIMP－1診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線

表2 血清MMP－13及TIMP－1對(duì)PHC的診斷敏感性及特異性（%）

各指標(biāo)（其中AFP以≥200μg／L的兩組總和計(jì)算）在微小肝癌（≤2cm）和＞2cm肝癌組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均 ＞0.05），MMP－13、TIMP－1單項(xiàng)或聯(lián)合檢測(cè)對(duì)不同大小肝癌的診斷敏感性均大于 AFP（P均＜0.01，表3）。MMP－13、TIMP－1單項(xiàng)或聯(lián)合檢測(cè)在不同TNM分期、AFP組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05，表4、表5）。

表3 MMP－13、TIMP－1及 AFP對(duì)微小肝癌的診斷價(jià)值 ［μg／L；n（%）］

表4 MMP－13、TIMP－1對(duì)不同TNM 分期肝癌的診斷價(jià)值 ［μg／L；n（%）］

表5 MMP－13、TIMP－1對(duì)不同 AFP水平肝癌的診斷價(jià)值 ［μg／L；n（%）］

2.4 PHC患者 MMP－13、TIMP－1與AFP三者之間的相關(guān)性分析

MMP－13、TIMP－1之間的相關(guān)系數(shù)r為0.442（P＜0.01）；MMP－13與 AFP之間的相關(guān)系數(shù)r為0.241（P＞0.05）；TIMP－1與 AFP之間的相關(guān)系數(shù)r為0.039（P＞0.05）。

3 討論

MMP－13作為MMP家族的一員，其作用底物極為廣泛，幾乎可降解細(xì)胞外基質(zhì)（matracellular matrix，ECM）的所有成分，其分解明膠的能力比MMP－1 和 MMP－8 強(qiáng) 40 倍［6］。MMP－13 在 乳 腺癌、頭頸部鱗狀上皮癌、皮膚癌、軟骨瘤等其它腫瘤中均有高表達(dá)，并與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)［7］。TIMP－1可抑制 MMPs及其酶原活化，從而造成MMPs降解活性降低、膠原纖維降解減少，是腫瘤發(fā)生惡變與轉(zhuǎn)移的抑制因素［8］。

本研究中，原發(fā)性肝癌組 MMP－13及TIMP－1水平高于其他各組（P＜0.01），說(shuō)明隨著疾病進(jìn)展，MMP－13、TIMP－1水平呈上升趨勢(shì)且原發(fā)性肝癌組MMP－13水平相對(duì)于TIMP－1上升的幅度比肝硬化組高。ROC曲線下面積越大，說(shuō)明診斷價(jià)值越大，準(zhǔn)確性越高，曲線下面積為0.5－0.7時(shí)，表示診斷的準(zhǔn)確性較低；0.7－0.9時(shí)，中等；0.9以上時(shí)，準(zhǔn)確性較高［9］。本研究顯示 MMP－13及 TIMP－1ROC 曲線下面積分別為0.93、0.88，表明兩者對(duì)PHC均有較高診斷價(jià)值且MMP－13優(yōu)于TIMP－1。

MMP－13、TIMP－1的平行聯(lián)合試驗(yàn)的敏感性、特異性分別為0.97、0.69；系列聯(lián)合試驗(yàn)分別為0.68、0.97。在臨床實(shí)際應(yīng)用中，作為肝癌診斷性試驗(yàn)必須要有較高特異性［10］，可選擇系列聯(lián)合試驗(yàn)，而在患者篩檢以及動(dòng)態(tài)觀察時(shí)可選擇平行聯(lián)合試驗(yàn)以提高檢測(cè)敏感性。

AFP對(duì)肝癌診斷陽(yáng)性率僅60%左右，且存在一定的假陽(yáng)性［11］，故選擇合適的互補(bǔ)診斷指標(biāo)具有重要意義。本研究中MMP－13及TIMP－1單項(xiàng)或聯(lián)合檢測(cè)對(duì)在不同大小腫瘤的診斷陽(yáng)性率均明顯優(yōu)于AFP（P＜0.05），且其陽(yáng)性率在腫瘤直徑≤2cm及＞2cm兩組間以及不同TNM分期組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3、表4），表明對(duì)PHC診斷價(jià)值優(yōu)于AFP且對(duì)微小肝癌、早期肝癌均有較高的診斷價(jià)值。此外從表5可以看出，MMP－13及TIMP－1單項(xiàng)或聯(lián)合檢測(cè)陽(yáng)性率在不同AFP濃度組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這進(jìn)一步表明MMP－13及TIMP－1與AFP間無(wú)明顯相關(guān)性，可作為AFP之外的肝癌血清診斷標(biāo)志物。

影像學(xué)對(duì)微小肝癌有較高檢出率［12］，但局限性在于腫瘤已形成，不能作出預(yù)警，血清 MMP－13、TIMP－1聯(lián)合檢查利于疾病動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，由于 MMP－13、TIMP－1在良、惡性肝病中的差異表達(dá)，其動(dòng)態(tài)檢測(cè)有助于了解疾病的進(jìn)展。血清 MMP－13、TIMP－1可望成為一種新的肝癌標(biāo)志物，其在肝癌手術(shù)前后的變化及對(duì)復(fù)發(fā)的診斷價(jià)值尚需進(jìn)一步研究。

［1］倪潤(rùn)洲，楊 磊，肖明兵，等.血清 HS－AFP GGT－II對(duì)肝癌患者手術(shù)預(yù)后判斷的價(jià)值［J］.中國(guó)腫瘤臨床，2007，34（4）：204.

［2］Cong M，Liu T，Wang P，et al.Suppression of tissue inhibitor of metalloproteinase－1by recombinant adeno－associated viruses carrying siRNAs in hepatic stellate cells［J］.Int J Mol Med，2009 ，24（5）：685.

［3］F.L.格林尼，D.L.佩基，I.D.弗萊明，等.AJCC癌癥分期手冊(cè)［M］.第六版.沈陽(yáng)：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，2005：133.

［4］中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲(chóng)病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì).病毒性肝炎防治方案［J］.中華傳染病雜志，2001，19（1）：56.

［5］中國(guó)抗癌協(xié)會(huì)肝癌專(zhuān)業(yè)委員會(huì).原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)［J］.中華肝臟病雜志，2001，9（6）：324.

［6］Gottschalk C，Malberg K，Arndt M，et al.Matrix metalloproteinases and TACE play a role in the pathogenesis of endometriosis［J］.Adv Exp Med Biol，2000，477：483－486.

［7］Leeman MF，Curran S，Murray GI.The structure，regulation，and function of human matrix metalloproteinase－13［J］.Crit Rev Biochem Mol Biol，2002，37（3）：149.

［8］侯元婕，薛克修.基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制因子與組織纖維化的研究進(jìn)展［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，23（2）：204.

［9］陳衛(wèi)中，倪宗瓚，潘曉平，等.用ROC曲線確定最佳臨界點(diǎn)和可疑值范圍［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，32（7）：729.

［10］林果為，沈福民.現(xiàn)代臨床流行病學(xué)［J］.第2版.上海：復(fù)旦大學(xué)出版社，2008：49.

［11］方青青，倪潤(rùn)洲，肖明兵，等.肝癌組織和血清中半乳糖血凝素－3的表達(dá)及其意義［J］.中華肝臟病雜志，2011，19（7）：527－531.

［12］陳文軍，程 明，王恩鋒，等.多層螺旋CT對(duì)微小肝癌的診斷研究［J］.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，45（1）：67.