miR－31在人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT－29對RhoBTB1表達(dá)的影響

徐瑞斯，張 斌

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 內(nèi)鏡中心，吉林 長春130033）

結(jié)腸癌（colon cancer）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，每年死亡病例居各種惡性腫瘤第三位［1］。目前為止，根治結(jié)腸癌最有效的方法還是手術(shù)切除聯(lián)合化療，對于局部腫瘤5年生存率達(dá)到93%［2］。microRNA（miRNA）是一種大小19－24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子，能夠通過排序這些基因的3’段非編碼區(qū)調(diào)整下游目標(biāo)基因，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種重要細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控［2］。迄今為止，人們發(fā)現(xiàn)了1500多種miRNA序列［3］。越來越多的證據(jù)表明miRNA在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起著非常重要的作用［4，5］，很多miRNA在腫瘤中的表達(dá)是上調(diào)的或者是下調(diào)的［6，7］。

miRNA－31在惡性腫瘤的發(fā)生中起著非常重要的作用。有報(bào)道稱miRNA－31結(jié)腸癌表達(dá)是顯著上調(diào)，而且其表達(dá)水平在結(jié)腸癌的各個(gè)階段是相互關(guān)聯(lián)的［8，9］。有報(bào)道稱 miRNA－31與結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，抑制miRNA－31的表達(dá)可以影響結(jié)腸細(xì)胞的遷移和侵襲［10］。RhoBTB是Rho家族小分子鳥苷酸三磷酸酶（Rho GT Pases），是RhoBTB亞家族成員。最近報(bào)道指出在頭頸癌中，RhoBTB1也是一種抑癌蛋白［11］。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT－29來自于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC），為復(fù)旦大學(xué)李志剛老師惠贈。90%RPMI1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清，加100U／ml青霉素和100U／ml鏈霉素，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 對照RNA和miR－31mimics分別轉(zhuǎn)染HT－29細(xì)胞。將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染之前24h接種到24孔板上（2.5－3×104／well）。取1μl轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000（Invitrogen）加入50μl（不含抗生素及血清）培養(yǎng)液中，同時(shí)將1.25μlmiR－31mimics儲存液加入50μl（不含抗生素及血清）培養(yǎng)液中。將兩者混勻后加400μl（不含抗生素及血清）培養(yǎng)液，加入培養(yǎng)液清洗后的培養(yǎng)細(xì)胞上。37℃培養(yǎng)5－6h，換液。37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h之后，收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.3 預(yù)測靶基因 使用在線miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫（http：／／www.targetscan.org），我們假定RhoBTB1是miR－31的靶蛋白。（如圖1A）

1.4 熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建 采用PCR方法擴(kuò)增RhoBTB1基因的3’UTR序列，并構(gòu)建其突變型序列，擴(kuò)增出來的序列經(jīng)酶切后，連入pGL3載體螢火蟲熒光素酶序列的3’端，所有構(gòu)建好的質(zhì)粒均經(jīng)DNA測序檢驗(yàn)。

1.5 熒光素酶基因報(bào)告分析 將培養(yǎng)好的細(xì)胞于轉(zhuǎn)染之前24h接種到24孔板中，將熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與miR－31mimics共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48h之后進(jìn)行熒光素酶活性的測定。

1.6 RT－PCR 用TRIzol試劑（Invitrogen）從細(xì)胞和腫瘤組織中提取總RNA。我們用莖環(huán)RT－PCR方法進(jìn)行miR－31的檢測。RhoBTB1mRNA的檢測使用M－MLA反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)（Promega）將RNA逆轉(zhuǎn)錄 成cDNA。qRT－PCR的使用SYBR Green qPCR Master Mix（Tiangen）在 ABI 7300（Applied Biosystems，F(xiàn)oster，CA）。GAPDH作為內(nèi)參。

1.7 western－blotting 按指示轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞收集并在RIPA裂解緩沖液（150mM NaCl，10mM Tris，pH7.5，1%NP40，1%脫氧膽酸鹽，0.1%SDS，蛋白酶抑制劑混合物（sigma））裂解和使用Bradford protein assay（Bio－Rad，Hercules，CA）測定總蛋白。等量的蛋白樣品進(jìn)行10%SDS－PAGE電泳，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜（Millipore，Billerica，USA），室溫下在5%脫脂牛奶封閉30min，然后室溫下在anti－RhoBTB1（1∶2000，Abcam）中孵育2h，隨后室溫下加山葵過氧化物酶連接二抗孵育1h，使用ECL（Millipore，MA，USA）觀察。β－actin（1∶5000，Abcam）作為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SSPS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)方法t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RhoBTB1是 microRNA－31的靶蛋白

由于miRNA的調(diào)控目標(biāo)基因mRNA的翻譯和凋亡是通過和靶基因3＇UTR的直接結(jié)合而相互作用，我們試圖尋找miR－31的靶基因，以進(jìn)一步揭示其結(jié)腸癌發(fā)生機(jī)制中的影響。通過使用miRNA靶基因預(yù)測的數(shù)據(jù)庫（http：／／www.targetscan.org），我們假定 RhoBTB1為 miR－31的靶基因（圖1A）。研究RhoBTB1是否為miR－31的直接靶基因，我們應(yīng)用了熒光素酶報(bào)告基因檢測。

首先，我們構(gòu)建了熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒包含RhoBTB1 3＇UTR序列（WT－RhoBTB1）或刪除預(yù)測的 miR－31的靶基因位點(diǎn)（mut－RhoBTB1）。如顯示在圖1B后，共同轉(zhuǎn)染的wt－RhoBTB1質(zhì)粒，與對照miR轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，miR－31轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的熒光素酶活性的顯著減少，而與mut－RhoBTB1質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶的活性沒有改變。兩者合計(jì)，這些結(jié)果表明了miR－31針 對3＇UTR直接調(diào)控RhoBTB1。

圖1 A 靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫中miR－31靶基因的預(yù)測結(jié)果

圖1 B miR－31轉(zhuǎn)染HT－29細(xì)胞后，熒光素酶的檢測結(jié)果

2.2 miR－31的下調(diào)RhoBTB1在HT29細(xì)胞中的表達(dá)

RhoBTB是Rho家族小分子鳥苷酸三磷酸酶，由3名成員組成，有報(bào)道稱兩名成員RhoBTB1和RhoBTB2為抑癌基因。我們發(fā)現(xiàn)RhoBTB1為人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29中miR－31的靶蛋白，接下來我們研究miR－31對RhoBTB1表達(dá)的影響。與轉(zhuǎn)染對照RNA的 HT29細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR－31mimics HT29細(xì)胞的RhoBTB1mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)（圖2A），western－blotting結(jié)果顯示miR－31表達(dá)抑制之后RhoBTB1蛋白表達(dá)水平上調(diào)（圖2B）。在結(jié)腸癌組織中miR－31的上調(diào)抑制RhoBTB1的表達(dá)。

圖2 A miR－31mimics轉(zhuǎn)染HT－29細(xì)胞，RhoBTB1的mRNA表達(dá)水平比較

圖2 B miR－31mimics轉(zhuǎn)染HT－29細(xì)胞，RhoBTB1的蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

miRNA是內(nèi)源性表達(dá)的小非編碼RNA，它控制目標(biāo)信使RNA基因的表達(dá)。據(jù)估計(jì)，在人類，基因編碼的miRNA的數(shù)量約3%，這可能調(diào)節(jié)30%蛋白質(zhì)的編碼基因［12，13］。確實(shí)的證據(jù)說明，miRNA人類癌組織中表達(dá)異常，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［14，15］。

為了確定 miR－31的靶基因，我們使用TargetScan sorftware，分析結(jié)果表明，腫瘤抑癌基因RhoBTB1的可能是miR－31的靶基因。RhoBTB1屬于RhoBTB亞家族。RhoBTB蛋白是Rho家族小分子鳥苷酸三磷酸酶的非典型成員。Rho GTP酶作為分子開關(guān)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白，被認(rèn)為是細(xì)胞骨架重構(gòu)的主要調(diào)節(jié)分子，越來越多的證據(jù)表明，他們也參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，也有報(bào)道稱Rho GTP酶參與腫瘤的發(fā)展［16－18］。

RhoBTB亞家族被證實(shí)是在2001年在真核細(xì)胞盤基網(wǎng)柄菌的基因編碼Rho－相關(guān)蛋白的研究中。和其他典型的RhoGTPases不同，RhoBTB蛋白質(zhì)不是調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白系統(tǒng)?，F(xiàn)在，RhoBTB的家族兩名成員，RhoBTB2和RhoBTB1，被認(rèn)為是腫瘤抑制蛋白。RhoBTB1，位于10q21，在（HNSCC）的發(fā)展有一定的作用。

我們的研究表明，抑癌蛋白RhoBTB1是miR－31的靶蛋白。microRNA－31能夠下調(diào)RhoBTB1在HT29細(xì)胞中的表達(dá)量。miRNA－31在調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。對miRNA的深入研究無疑能增進(jìn)對大腸癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等機(jī)制的認(rèn)識，促進(jìn)診斷和治療的快速發(fā)展。闡明大腸癌相關(guān)miRNA的作用機(jī)制將可能豐富大腸癌的病因?qū)W及分子病理學(xué)理論，為大腸癌診斷治療提供新策略和思路。如能根據(jù)此研究研制出抗腫瘤新藥，給社會及經(jīng)濟(jì)方面帶來深遠(yuǎn)的影響。

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