雷帕霉素與大鼠肝纖維化演變的相關(guān)研究

鐘志宏，戴 東，陳土明，吳祖超

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 肝膽外科，廣東 湛江524001）

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF－β1）是屬于一組新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的TGF－β超家族，研究顯示TGF－β1在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)選擇大鼠肝纖維化模型，應(yīng)用mTOR受體抑制劑雷帕霉素（RAPA）治療，觀察其對(duì)大鼠肝臟TGF－β1的表達(dá)及雷帕霉素對(duì)肝纖維化的影響，探討雷帕霉素在肝纖維化演變中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型的制備 成年健康雄性SD大鼠24只，體重200－250g，由廣東醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。按四氯化碳油（CCl4油）誘導(dǎo)建立大鼠肝纖維化模型。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 24只SD大鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組（A組）、肝纖維化模型組（B組）、雷帕霉素組（C組）每組8只。B、C組建立模型；C組按雷帕霉素2mg／kg體重胃內(nèi)灌灌注，每天1次，持續(xù)2周。A、B組按同劑量予生理鹽水灌胃，每天1次，持續(xù)2周。同期處死取肝臟組織切片，對(duì)肝組織切片分別行HE染色及免疫組織化學(xué)法處理，相片用Imagepro plus 6.0圖像分析軟件處理。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)各組間比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）

2 結(jié)果

2.1 HE染色對(duì)肝臟組織的變化 見圖1。

2.2 雷帕霉素對(duì)肝臟TGF－β1表達(dá) 見圖2，表1。

圖1 HE染色對(duì)肝臟組織的變化

圖2 雷帕霉素對(duì)肝臟TGF－β1表達(dá)

表1 大鼠肝臟組織TGF－β1的陽(yáng)性表達(dá)

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，TGF－β1可促進(jìn)肝纖維化，通過TGF／Smad信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控ECM的沉積，TGF－β1的大量表達(dá)，促使ECM過度沉積，加速肝纖維化。在肝硬化形成過程中抑制、緩解及延緩病程發(fā)展是基礎(chǔ)與臨床研究的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)病理HE染色及免疫組織化學(xué)結(jié)果觀察到，模型組中肝纖維化明顯，纖維間隔穿插其中；應(yīng)用雷帕霉素2周后，TGF－β1表達(dá)明顯下降，纖維間隔程度也較模型組減少。結(jié)果顯示，雷帕霉素可抑制纖維肝大鼠肝組織中TGF－β1表達(dá)。TGF－β在正常肝臟組織中轉(zhuǎn)錄水平很低，而在肝纖維化模型中，在大多數(shù)的間充質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞、肝細(xì)胞中TGF－βRNA轉(zhuǎn)錄處于高水平，TGF－β家族中尤以TGF－β1在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用［1］。相關(guān)資料對(duì)HSC凋亡的調(diào)節(jié)因子主要有抑制HSC凋亡的生長(zhǎng)因子如TNF－α、TGF－β、IFN－α、leptin 等［2］，而細(xì)胞因子中只有TGF－β能刺激HSC合成膠原纖維，而其他細(xì)胞因子僅刺激HSC增殖［3］，TGF－β通過TGF／Smad信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控ECM的沉積。在肝纖維化進(jìn)展期中，Kupffer Cell（KC）通過自分泌或旁分泌途徑分泌大量TGF－β1，同時(shí)增加HSC上血小板衍生因子（PDGF）受體表達(dá)，通過自分泌循環(huán)分泌TGF－β1和PDGF，使HSC持續(xù)活化，抑制其凋亡。大鼠星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)活化后形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，有研究者認(rèn)為，HSC是成纖維細(xì)胞前體，在肝損傷時(shí)HSC活化轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，分泌ECM、細(xì)胞因子和蛋白酶抑制劑等成分參與肝纖維化進(jìn)展［4］。雷帕霉素改善肝纖維化，與多途徑調(diào)控TGF－β1表達(dá)相關(guān)。RAPA作為PI3K／AKT／mTOR信號(hào)通路抑制劑，抑制其激酶活性，阻斷其細(xì)胞通路，抑制下游S6K1和4EBP1的磷酸化，從而抑制細(xì)胞分化和增殖［5－7］。KC作為肝臟固定于肝竇竇壁的巨噬細(xì)胞，RAPA阻斷 巨噬細(xì)胞的PI3K／AKT／mTOR通路，減少細(xì)胞因子如 TNF－α、TGF－β1等的釋放，抑制HSC增殖活化，促進(jìn)HSC的凋亡，減少HSC轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，使ECM沉積減輕。單側(cè)輸尿管梗阻的老鼠模型中，通過封閉mTOR信號(hào)通路，抑制巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，可以有效的改善患側(cè)腎臟的纖維化［8］。RAPA也可以直接作用于HSC的Fas／Fasl系統(tǒng)，抑制細(xì)胞周期凋亡相關(guān)基因Bcl－2的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)Fas／FasL系統(tǒng)中的重要因子Fas的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)凋亡基因P53表達(dá)增多，啟動(dòng)Fas／FasL凋亡通路，上調(diào)P53、下調(diào)Bcl－2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)HSC凋亡，抑制增殖［9，10］，減少 ECM 的沉積。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用mTOR信號(hào)通路抑制劑雷帕霉素，檢測(cè)大鼠肝臟組織的病理形態(tài)改變及TGF－β1的表達(dá)，探討雷帕霉素在肝纖維化進(jìn)展中相關(guān)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：應(yīng)用雷帕霉素大鼠，肝組織TGF－β1的表達(dá)明顯降低，肝臟組織纖維化得以改善。

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