rhKD／APPvar對(duì)實(shí)驗(yàn)性慢性肝損傷肝組織纖維化影響的研究

孟威宏，王虹蛟，王 強(qiáng)＊，顏煒群，任立群

（1.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng)110015；2.長(zhǎng)春解放軍第461醫(yī)院；3.吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所）

關(guān)于肝纖維化機(jī)制及防治研究，目前是國(guó)內(nèi)外生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一［1－6］。本論文利用實(shí)驗(yàn)鼠的四氯化碳（CCl4）慢性肝損傷模型，同時(shí)利用膠原纖維染色檢測(cè)方法觀察重組人淀粉樣蛋白前體中的Kunitz型蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域變異體（reorganization human KD／APP variant，rhKD／APPvar）對(duì)實(shí)驗(yàn)性慢性肝損傷大鼠肝組織纖維化改變的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，雌雄兼用，由長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物研究中心提供。合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第1055113。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠慢性CCl4肝損傷模型的建立 Wistar大鼠，體重190－210g，雌雄各半，由高新實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用新鮮的花生油作為溶劑。將25%CCl4溶解于花生油中混勻。正常對(duì)照組僅皮下注射花生油5ml／kg，其它各組大鼠首次給予CCl4原液5ml／kg，以后每周2次25%CCl4液（花生油稀釋）5ml／kg皮下注射。禁食，不禁水。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 取Wistar大鼠70只（體重190－210g，雌雄各半），隨機(jī)分為7組，每組10只。

第1組為正常對(duì)照組（空白組）：腹腔注射等量生理鹽水。

第2組為CCl4中毒模型組（模型組）：腹腔注射等量生理鹽水。

第3組為rhKD／APPvar小劑量組：腹腔注射2萬(wàn)KIU·kg－1。

第4組為rhKD／APPvar中劑量組：腹腔注射4萬(wàn)KIU·kg－1。

第5組為rhKD／APPvar大劑量組：腹腔注射8萬(wàn)KIU·kg－1。

第6組為抑肽酶組：腹腔注射抑肽酶4萬(wàn)KIU·kg－1。

第7組為rhKD／APP組：腹腔注射rhKD／APP 4萬(wàn)KIU·kg－1。

3－5組每天給予rhKD／APPvar一次，連用4周，第6組每天給予抑肽酶注射液一次，連用4周。第7組每天給予rhKD／APP一次，連用4周。禁食，不禁水。

1.2.3 膠原纖維染色 末次給藥1h后處死大鼠，取肝大葉相同部位的一小塊肝組織固定于10%福爾馬林，常規(guī)法制做組織切片，利用Masson氏染色法染色進(jìn)行膠原纖維染色后，在光鏡下觀察肝細(xì)胞變性壞死程度、肝間質(zhì)纖維增生程度。

Masson染色法：切片脫蠟至水；1%高錳酸鉀氧化切片5min；水洗，草酸漂白1min；水洗，蒸餾水洗，天青石藍(lán)染5min水洗；摔去余液不用水洗，滴染Mayer氏蘇木素3－5min；流水沖洗5－10min；麗春紅苦味酸飽和液染5min；1%醋酸水溶液洗；1%磷鉬酸分化切片約5min；蒸餾水洗；1%淡綠或者甲苯胺藍(lán)滴染30s；1%醋酸水溶液洗切片；95%酒精分化，無(wú)水酒精脫水；二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。

結(jié)果判定：膠原纖維呈現(xiàn)綠色或藍(lán)色，細(xì)胞核呈現(xiàn)灰黑或灰藍(lán)色，胞質(zhì)紅細(xì)胞呈現(xiàn)紅色。利用O－lympus圖像分析軟件，自動(dòng)分析藍(lán)染膠原面積，并計(jì)算其相對(duì)面積，即與總面積的比值。每組隨機(jī)選擇50個(gè)視野進(jìn)行比較。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，各組之間數(shù)據(jù)比較均采用兩組資料秩和檢驗(yàn)的方法。

2 結(jié)果

利用Masson氏染色法染色肝組織膠原纖維以評(píng)測(cè)肝組織纖維化程度。膠原纖維被染為藍(lán)色或綠色，其它細(xì)胞、組織以紅色著色為主。利用Olympus圖像分析軟件自動(dòng)分析藍(lán)染膠原面積?？瞻讓?duì)照組極少見(jiàn)著色的膠原纖維，僅在血管周圍可見(jiàn)少量藍(lán)染膠原纖維區(qū)域（圖1），相對(duì)膠原面積為（1±0.02）%。模型對(duì)照組膠原纖維增生明顯，穿插肝組織形成較為明顯的假小葉，膠原纖維總面積大（圖2），相對(duì)膠原面積為（31±5.25）%。rhKD／APPvar小劑量組膠原纖維增生明顯，相對(duì)膠原面積為（28±7.78）%，同模型組相比無(wú)明顯減輕趨勢(shì)（圖3）。rhKD／APPvar中劑量組，膠原纖維增生以局部多見(jiàn)，較少相互交叉形成假小葉（圖4），相對(duì)膠原面積為（21±6.24）%，與模型組相比膠原面積顯著減少（P＜0.05）。rhKD／APPvar大劑量組，膠原纖維增生較輕，匯管區(qū)及血管周圍可見(jiàn)輕度膠原纖維增生，無(wú)假小葉形成（圖5），相對(duì)膠原面積為（8±2.21）%，與模型組相比顯著降低（P＜0.05）。抑肽酶組及rhKD／APP組膠原纖維增生明顯，以匯管區(qū)居多，假小葉形成較少（圖6，7），相對(duì)膠原面積分別為（23±4.87）%和（26±10.21）%。與模型組相比顯著降低（P＜0.05），但高于rhKD／APPvar大劑量組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rhKD／APPvar能夠顯著抑制大鼠肝臟纖維化。

圖1 空白對(duì)照組相對(duì)膠原面積為（1±0.02）%（200×）

圖2 模型組相對(duì)膠原面積為（31±5.25）%（200×）

3 討論

肝纖維化是慢性肝病造成的，是一個(gè)常見(jiàn)的世界性難題。四氯化碳（Carbon Tetrachloride，CCl4）作為經(jīng)典的親肝毒物，主要經(jīng)呼吸道和消化道進(jìn)入體內(nèi)，對(duì)人和動(dòng)物均可致肝損傷。目前國(guó)內(nèi)外多采用CCl4建立肝損傷模型［7，8］。但肝纖維化具逆轉(zhuǎn)的可能性。從本質(zhì)上講，慢性肝病的治療就是肝纖維化的治療，主要是祛除原發(fā)病的病因和抗肝纖維化治療，因此，肝纖維化的治療和抗肝纖維化的治療有不同的概念與范圍。目前根據(jù)抗纖維化藥物作用于纖維化過(guò)程的不同環(huán)節(jié)大致可分為5類：①細(xì)胞保護(hù)類：本類藥物的作用機(jī)制為保護(hù)肝細(xì)胞阻止其凋亡?，F(xiàn)已證實(shí)熊去氧膽酸（UDCA）對(duì)原發(fā)性膽汁性肝纖維化有效。二甲基前列腺素E2（DMPGE2）可抑制鼠慢性營(yíng)養(yǎng)性肝損傷模型肝內(nèi)膠原的沉積；也有報(bào)道DMPGE2顯著改善CCl4誘發(fā)大鼠肝纖維化模型的肝纖維化程度，并認(rèn)為肝細(xì)胞保護(hù)作用是前列腺素抗肝纖維化的機(jī)制之一；②HSC活化抑制類：其中主要藥物首推干擾素（interferon，INF）。目前認(rèn)為α和γ型干擾素具有明顯的抗肝纖維化作用。國(guó)外研究INF－γ抗肝纖維機(jī)制主要為阻止HSC的增殖和活化，減少膠原成分的mRNA轉(zhuǎn)錄，從而減少ECM成分的表達(dá)。此外，INF－γ還具有阻止肝纖維化進(jìn)一步發(fā)展以及減低纖維化水平的作用；③中和細(xì)胞因子活性類：血小板衍生因子（PDGF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF－β）是 HSC活化及產(chǎn)生ECM的主要細(xì)胞團(tuán)子。因此設(shè)想，中和兩種細(xì)胞因子的活性是一種有發(fā)展?jié)摿Φ目估w維化療法；④抑制ECM合成及分泌類：a.脯氨酸羥化酶抑制物：脯氨酸羥化酶竟?fàn)幮砸种莆锟梢种聘彼岬?/p>

羥化反應(yīng)，減少前膠原三股螺旋α肽鏈的穩(wěn)定性。其中二羧基吡啶衍生物經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明具有抗纖維化、抑制HSC活化的作用?？诜\制劑可在脯氨酸羥化酶的活性部位與Fc競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合而抑制此酶活性，減少膠原物質(zhì)在肝臟的沉積。b.山黧豆素（lthyrogen）：本藥含有β－氨基丙腈和氨基已腈，可以阻止膠原纖維和彈力纖維的架橋連接。目前本藥對(duì)肝纖維化的治療尚未用于臨床，仍處于實(shí)驗(yàn)階段。c.銅離子絡(luò)合劑：D－青霉胺用于臨床上肝豆?fàn)詈俗冃运赂卫w維化的治療具有一定療效，但對(duì)其他原因所致肝纖維化并無(wú)明顯療效。d.秋水仙堿（colchicie）：其作用機(jī)制為抑制微管蛋白的聚合，從而干擾細(xì)胞膠原分泌。⑤促進(jìn)ECM降解類：主要是指具有膠原酶活性或促進(jìn)膠原酶活性藥物。有人報(bào)告大黃酸、來(lái)氟米特對(duì)CCl4所致的大鼠肝纖維化有保護(hù)抑制作用［9］。CCl4導(dǎo)致肝損傷機(jī)制目前認(rèn)為與CCl4自身和其自由基代謝產(chǎn)物有關(guān)。在鼠CCl4肝損傷期間，腫瘤壞死因子受體－1（TNFR－1）介導(dǎo)的信號(hào)是損傷后促有絲分裂應(yīng)答的主要成分［10－11］。近年來(lái)，隨著對(duì)肝纖維化的形成機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入及基因治療技術(shù)的發(fā)展，采用基因調(diào)節(jié)治療，阻斷肝臟內(nèi)炎癥及纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，日益引起學(xué)者們的重視［12］。但基因治療肝纖維化進(jìn)入臨床試驗(yàn)恐非短期內(nèi)能達(dá)到目的。

圖3 rhKD／APPvar小劑量組相對(duì)膠原面積為（28±7.78）% （200×）

圖4 rhKD／APPvar中劑量組相對(duì)膠原面積為（21±6.24）% （200×）

圖5 rhKD／APPvar大劑量組相對(duì)膠原面積為（8±2.21）% （200×）

圖6 抑肽酶組相對(duì)膠原面積為（23±4.87）%（200×）

圖7 rhKD／APP組相對(duì)膠原面積為（26±10.21）%（200×）

淀粉樣蛋白前體中的Kunitz型蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域（Kunitz protease inhibitor domain of amyloid protein precursor，KD／APP）是人 Kunitz型蛋白酶抑制劑（Kunitz protease inhibitor，KPI），具有強(qiáng)烈抑制絲氨酸蛋白酶的活性，是較理想的牛胰蛋白酶抑制劑（Bovine pancreatic trypsin inhibitor，BPTI）替代品。本研究采用重組人淀粉樣蛋白前體中的Kunitz型蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域變異體（reorganization human KD／APP variant，rhKD／APP－var），通過(guò)建立慢性肝損傷的動(dòng)物模型，觀察rhKD／APPvar在慢性肝損傷中的保護(hù)作用。結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)照組膠原纖維增生明顯，穿插肝組織形成較為明顯的假小葉，膠原纖維總面積大。rhKD／APPvar小劑量組膠原纖維增生明顯，同模型組相比無(wú)明顯減輕趨勢(shì)。rhKD／APPvar中劑量組，膠原纖維增生以局部多見(jiàn)，較少相互交叉形成假小葉，與模型組相比膠原面積顯著減少（P＜0.05）。rhKD／APPvar大劑量組，膠原纖維增生較輕，匯管區(qū)及血管周圍可見(jiàn)輕度膠原纖維增生，無(wú)假小葉形成，與模型組相比顯著降低（P＜0.05）。BPTI組及rhKD／APP組膠原纖維增生明顯，以匯管區(qū)居多，假小葉形成較少，與模型組相比顯著降低（P＜0.05），但高于rhKD／APPvar大劑量組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rh－KD／APPvar能夠顯著抑制大鼠肝臟纖維化，其大劑量效果優(yōu)于BPTI和rhKD／APP組。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rhKD／APPvar對(duì)大鼠慢性CCl4肝損傷模型具有很好的保護(hù)性作用，明顯減輕慢性肝損傷的程度，抑制肝纖維化的發(fā)展。盡管其作用機(jī)制還不清楚，但從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以認(rèn)為是從減輕肝細(xì)胞的損傷及抑制肝纖維化的發(fā)展兩個(gè)方面對(duì)慢性肝損傷起到保護(hù)性作用的。

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