葛根素對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌酶的影響

李 軍，黃可欣，王元春，石 博＊

（1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 血液腫瘤科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院 形態(tài)學(xué)中心；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 放射線科）

葛根（Puerariae Radix）為豆科植物野葛的干燥根。葛根素（Puerarin）是葛根的主要活性成分［1］，它是具有抗心律失常、抗心肌缺血、抗缺血再灌注損傷等作用［2，3］。在臨床上葛根素注射液被廣泛用于治療心血管疾病，且具有較好的療效［4，5］。雖然很多學(xué)者對(duì)其治療心血管疾病的機(jī)制進(jìn)行了探討［2，3］，但是葛根素對(duì)心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia－reperfusion injury，MIRI）是否具有減少心肌梗死面積、減輕心肌酶學(xué)改變的作用尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本文通過(guò)研究葛根素對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌梗死面積及心肌酶學(xué)的變化，進(jìn)一步探討葛根素的應(yīng)用對(duì)心肌缺血再灌注損傷大鼠心臟的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 210±10g健康雄性Wistar大鼠50只，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供（動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK2007－吉大－0003）；葛根素由南京正大天晴制藥公司提供（純度為99.8%）；實(shí)驗(yàn)用葛根素用生理鹽水稀釋?zhuān)籆K、LDH、NO、XO、SOD、MDA、GSH、GSH－Px試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 造模方法 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組（S組），僅穿線，不結(jié)扎LAD；缺血再灌注組（I／R組），于結(jié)扎LAD前30min右頸靜脈注射等容量生理鹽水，結(jié)扎30min后松扎，再灌注120min；葛根素各劑量組于結(jié)扎LAD前30min于右頸靜脈注射葛根素2、5、10mg／kg（為 A、B、C組），結(jié)扎30min后松扎，再灌注120min。采用利多卡因腹腔麻醉后，將大鼠固定于解剖臺(tái)，頸部消毒，行頸前正中切口暴露氣管，經(jīng)口腔用8號(hào)灌胃針頭進(jìn)行氣管插管并接動(dòng)物呼吸機(jī)（呼吸頻率60－80次／min，潮氣量7－9ml）。于左側(cè)第三或第四肋間打開(kāi)胸腔，輕壓將心臟擠出胸腔，剪開(kāi)心包，以冠狀動(dòng)脈主干為標(biāo)志，左心耳根部下方2mm處，在LAD面放置一小硅膠管連同冠脈用無(wú)創(chuàng)傷縫合線一起結(jié)扎，造成左心室室壁缺血。迅速將心臟送回胸腔，醫(yī)用縫合線的兩端留置體外備用。用長(zhǎng)嘴止血鉗將胸部皮膚和肌肉以及心臟掛線夾緊，防止發(fā)生氣胸。30min后，放松掛線，抽出硅膠管，形成再灌注模型。造模結(jié)束時(shí)，逐層縫合肌肉、皮膚，切口處注入少許青霉素注射液，碘伏消毒，預(yù)防感染。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 心肌梗死面積檢測(cè) 大鼠心肌缺血再灌注24h后，摘取心臟，做TTC染色明確未梗死與梗死心肌。未梗死區(qū)紅染、梗死區(qū)染為白色，采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析軟件測(cè)量。心肌梗死面積（%）＝（梗死區(qū)心肌面積／整個(gè)心肌面積）×100%。

1.3.2 心肌酶學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 大鼠缺血再灌注3h后，斷頭取血分離血清；心臟灌流結(jié)束取左心室游離壁全層心肌，制10%心肌組織勻漿，離心取上清液待測(cè)XO含量；按南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行CK、LDH、NO、XO、SOD、MDA、GSH、GSH－Px含量的檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，CK、LDH、NO、XO、SOD、MDA、GSH 及GSH－Px數(shù)據(jù)均以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積的檢測(cè) 與假手術(shù)組比較，I／R組大鼠的心肌梗死面積（78.35±3.12，%）明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與I／P組比較，高、中劑量葛根素組，心肌梗死面積（18.27±1.03，21.63±2.51，%）明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；低劑量葛根素組，心肌梗死面積（51.26±2.18，%）也減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并存在劑量反應(yīng)關(guān)系。

2.2 各組大鼠心肌酶學(xué)的檢測(cè) 與假手術(shù)組比較，I／R組大鼠的心肌酶學(xué)各指標(biāo)均發(fā)生顯著變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與I／R組比較，葛根素高、中劑量組均減少了心肌細(xì)胞磷酸肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）釋放、心肌組織黃嘌呤氧化酶（XO）活性及血清丙二醛（MDA）含量，提高了血清一氧化氮（NO）水平、血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－Px）活性及谷胱甘肽（GSH）含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），葛根素低劑量組各指標(biāo)與模型組無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表1，2。

表1 各組大鼠血清CK、LDH、NO活性及心肌組織XO含量的比較（n＝10，±s）

表1 各組大鼠血清CK、LDH、NO活性及心肌組織XO含量的比較（n＝10，±s）

＊P＜0.01，compared with Sham group；▼ P＜0.01，compared with Model group；◆P＜0.01，compared with Model group

Group CK（×103 U／L） LDH（×103 U／L） NO（mmol／l） XO（U／g）Sham group 0.48±0.09 0.23±0.07 48.72±3.25 35.16±2.94 Model group 9.12±1.03＊ 2.98±0.52＊ 29.15±2.21＊ 52.13±3.18＊A 組 8.73±1.24 2.59±0.41 24.25±2.63 48.21±2.57 B組 3.29±1.12◆ 1.35±0.37◆ 39.48±1.95◆ 40.77±2.46◆C組 1.72±0.61▼ 0.46±0.11▼ 44.27±3.01▼ 36.67±2.83▼

表2 各組大鼠血清SOD、MDA、GSH及GSH－Px活性的比較（n＝10，±s）

表2 各組大鼠血清SOD、MDA、GSH及GSH－Px活性的比較（n＝10，±s）

＊P＜0.01，compared with Sham group；▼ P＜0.01，compared with Model group；◆P＜0.01，compared with Model group

Group SOD（U／ml） MDA（U／ml） GSH－Px（U／ml） GSH（mg／L）Sham group 271.23±14.62 3.57±0.93 418.26±10.13 250.21±16.27 Model group 183.23±9.74＊ 6.94±0.37＊ 341.52±8.76＊ 195.31±9.15＊A 組 200.11±10.14 5.68±0.77 372.16±11.38 203.15±10.34 B組 241.25±11.04◆ 4.53±0.72◆ 382.16±10.82◆ 219.31±7.83 C組 257.81±8.73▼ 3.99±0.91▼ 400.31±12.62▼ 238.16±9.17▼

3 討論

近年來(lái)，氧化應(yīng)激在心血管疾病中作用日益受到重視，其中大量活性氧自由基（ROS）產(chǎn)生是形成氧化應(yīng)激的基本機(jī)制［6］。大量研究顯示：心肌缺血再灌注損傷會(huì)進(jìn)一步加大心肌缺血，心功能障礙程度比急性心肌梗死嚴(yán)重，病死率更高［7，8］。心肌缺血再灌注不可避免的導(dǎo)致心肌損傷，發(fā)生心肌缺血和梗死。本實(shí)驗(yàn)采用TTC染色區(qū)別梗死區(qū)和非梗死區(qū)，檢測(cè)心肌梗死的面積發(fā)現(xiàn)：與假手術(shù)組比較，I／R組大鼠的心肌梗死面積明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與I／R組比較，高、中劑量葛根素組，心肌梗死面積明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；低劑量葛根素組，心肌梗死面積也減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明葛根素能縮小心肌梗死范圍，保存了更多的存活心肌，研究發(fā)現(xiàn)，其縮小心肌梗死范圍機(jī)理與抗氧化應(yīng)激作用相關(guān)。本研究檢測(cè)心肌酶結(jié)果提示：與假手術(shù)組比較，I／R組大鼠的心肌酶學(xué)各指標(biāo)均發(fā)生顯著變化，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與I／R組比較，葛根素高、中劑量組均減少了心肌細(xì)胞磷酸肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）釋放、心肌組織黃嘌呤氧化酶（XO）活性及血清丙二醛（MDA）含量，提高了血清一氧化氮（NO）水平、血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－Px）活性及谷胱甘肽（GSH）含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），葛根素低劑量組各指標(biāo)與I／R組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；并存在劑量反應(yīng)關(guān)系，其心肌酶學(xué)指標(biāo)檢測(cè)與心梗面積檢測(cè)結(jié)果相符，表明葛根素對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷具有顯著的保護(hù)作用。

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