苯乙酸聯(lián)合5－氟尿嘧啶、順鉑對(duì)喉癌細(xì)胞株凋亡的影響及在荷瘤鼠動(dòng)物模型中的作用觀察

吳志圣，趙 明，金春順，陳 鷗

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院 耳鼻喉頭頸外科，吉林 長(zhǎng)春130041）

苯乙酸（phenylacetate acid，PA）是正常生物體中苯丙氨酸脫氨基的代謝產(chǎn)物，目前的文獻(xiàn)［1－3］表明，PA可以在體內(nèi)和體外抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。臨床證明單一用藥苯乙酸往往不能根治腫瘤，停藥后腫瘤容易復(fù)發(fā)，故國(guó)內(nèi)外的學(xué)者均主張聯(lián)合化療加放療治療以提高療效。我們采用苯乙酸聯(lián)合應(yīng)用5－Fu、CDDP作用于喉癌細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀、荷瘤鼠模型等方法，觀察聯(lián)合用藥組與單一藥物組對(duì)喉癌細(xì)胞凋亡作用，并制作荷瘤鼠模型進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。初步探討苯乙酸是否可以增強(qiáng)化療對(duì)喉癌細(xì)胞的凋亡作用，是否可以減少化療的毒副作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人喉癌細(xì)胞株Hep－2購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。苯乙酸（PA）由北京長(zhǎng)城化學(xué)試劑公司由吉林省應(yīng)化物理所提供。RPMI－1640人工合成培養(yǎng)液購(gòu)自GIBCO。胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品。5－Fu及順鉑購(gòu)于江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司。EM－1200EX型透射電子顯微鏡為日本產(chǎn)品。LKB－Ⅲ型超薄切片機(jī)為瑞典產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀Becton Dickinson產(chǎn)自美國(guó)。荷鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。鼠黑色素瘤細(xì)胞B16購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS獎(jiǎng)懲10.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞儀的檢測(cè) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hep－2細(xì)胞周期各時(shí)相的變化及細(xì)胞凋亡率。

1.2.2 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人喉癌細(xì)胞株 Hep－2細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞后制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞。

1.2.3 以900rpam／min離心，5min，PBS洗兩次；

1.2.4 70%乙醇重懸細(xì)胞，并使之固定12h以上；

1.2.5 取96孔培養(yǎng)板，每2孔為一組，每孔加入準(zhǔn)備的Hep－2細(xì)胞2×104／孔，每孔按預(yù)實(shí)驗(yàn)得到最佳抑瘤作用劑量加入不同濃度的PA、5－Fu和順鉑：PA 濃度20mg，5－Fu 20mg，CDDP 8mg，PA＋5－Fu＼20mg＋20mg，PA＋CDDP＼20mg＋8mg，并設(shè)對(duì)照組。于37℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別在24h終止培養(yǎng)。PBS洗兩次，調(diào)細(xì)胞濃度為1×106個(gè)／ml，RNAase消化后，加入 1.5ml PI（碘化丙啶5 mg／100ml）染色1h，過4S目網(wǎng)，上機(jī)檢測(cè)，混勻后上流式細(xì)胞儀做單參數(shù)分析，每份樣品檢測(cè)1×104個(gè)細(xì)胞。GI峰前面出現(xiàn)的亞2倍體峰即為凋亡峰。

1.3 荷瘤鼠動(dòng)物模型的建立及分組治療

1.3.1 鼠黑色素瘤細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)、凍存方法。C57BL／6小鼠荷B16腫瘤模型的建立及分組治療。

1.3.2 鼠C57BL／6，雄性鼠30只，6－8周齡，體重18g。

1.3.3 方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，用無血清 Hank’s洗滌2次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106個(gè)／ml，于鼠左后肢皮下注射鼠黑色素瘤B16細(xì)胞0.5ml（含細(xì)胞2×106），于接種的第5天將荷瘤鼠隨機(jī)分為6組，每組5只。第一組：?jiǎn)渭兘oPA組，第二組：?jiǎn)渭僀DDP組，第三組：?jiǎn)渭?－Fu組，第四組：PA＋CDDP組，第五組：PA＋5－Fu組，第六組：生理鹽水對(duì)照組。每只鼠接種PA均右側(cè)皮下給藥，注射量為0.5ml，濃度20μg／日。5－Fu及順鉑為胃腸給藥，5－Fu 20μg／日，順鉑：6mg／日，每日給藥一次，連續(xù)5天后停一天給藥，共計(jì)給藥14日，將鼠處死，測(cè)量瘤鼠左下肢腫瘤大小及重量，并作病理形態(tài)學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，分別用PA、5－Fu、CDDP及 PA＋5－Fu、PA＋CDDP作用 Hep－2細(xì)胞24h后，出現(xiàn)了凋亡峰，即流式細(xì)胞儀分析PI染色后低于G0／G1期出現(xiàn)的亞二倍體峰。結(jié)果顯示，PA增強(qiáng)5－Fu、CDDP對(duì)Hep－2的細(xì)胞的凋亡作用，對(duì)CDDP的作用更為顯著，與單一用藥組比具有顯著差異性，P＜0.05，藥物作用后細(xì)胞各時(shí)相變化及凋亡率與對(duì)照組比較差異非常顯著，P＜0.01，并且呈劑量依賴性增加，而對(duì)照組未見或僅見較低的二倍體峰（圖1－5）。

圖1 PA 20mg凋亡率3.9%

圖2 5－Fu 20mg凋亡率2.59%

圖3 CDDP 8mg凋亡率5.61%

圖4 PA＋5－Fu／20mg＋20mg凋亡率5.30%

圖5 PA＋CDDP／20mg ＋8mg凋亡率9.83%

2.2 荷瘤鼠聯(lián)合用藥狀況

2.2.1 在給藥后7日內(nèi)各組小鼠反應(yīng)靈敏，毛順，色澤光滑，飲食正常，體重增長(zhǎng)較快，各組小鼠體重增長(zhǎng)無顯著差異。自實(shí)驗(yàn)第8日起，5－Fu、CDDP組鼠出現(xiàn)厭食、倦縮懶動(dòng)，體重增長(zhǎng)減慢，對(duì)照組至實(shí)驗(yàn)結(jié)束出現(xiàn)全身重量減輕，瘤體增長(zhǎng)快，鼠一般狀態(tài)欠佳，怠倦。PA＋5－Fu及PA＋CDDP組出現(xiàn)上述癥狀時(shí)間晚，于給藥半個(gè)月后才出現(xiàn)上述癥狀，且癥狀輕，以PA組鼠狀態(tài)最好。從生存率看鼠實(shí)驗(yàn)中共計(jì)死亡4只：5－Fu組2只，CDDP組1只，PA＋5－Fu組1只。5－Fu組于用藥第8天給藥時(shí)，死亡1只，在給藥第14天不明原因死亡1只，CDDP組，于第15天不明原因死亡1只；PA＋5－Fu組注射第7天1只鼠出現(xiàn)頸部皮下氣腫，于次日死亡，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，5－Fu組、CDDP組鼠死亡較高，而聯(lián)合用藥組、PA組鼠生存時(shí)間較長(zhǎng)。

2.2.2 測(cè)鼠體重開始14天內(nèi)，測(cè)量各組鼠體重?zé)o明顯變化。14天后，腫瘤對(duì)照組隨著瘤體迅速增大，體重增加較明顯。但25天后，鼠體重減輕，單一化療用藥組，實(shí)驗(yàn)前期，鼠體重增長(zhǎng)較對(duì)照組比顯著差異。實(shí)驗(yàn)后期，鼠體重明顯減輕，呈衰竭狀態(tài)，鼠死亡較多。聯(lián)合用藥組PA＋5－Fu、PA＋CDDP組，鼠體重略減輕。鼠瘤體大小測(cè)量顯示，對(duì)照組瘤體增長(zhǎng)較大，而PA＋CDDP組，瘤體變小，（表1）測(cè)量瘤體重結(jié)果對(duì)照組與聯(lián)合用藥組PA＋CDDP組比，差異具有顯著性。

2.2.3 腫瘤病理形態(tài)學(xué)觀察HE染色顯示，PA組無病變，而5－Fu組一只鼠有肺部炎癥改變且較重；PA＋CDDP組，一只鼠也有炎癥改變，但較輕，（圖6、圖7）。瘤體HE染色顯示對(duì)照組瘤細(xì)胞生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞形態(tài)良好，而聯(lián)合用藥組瘤體內(nèi)細(xì)胞有較多壞死灶（圖8、圖9），說明聯(lián)合用藥組對(duì)瘤體產(chǎn)生了抑制殺傷作用。

表1 PA、CDDP、5－Fu及聯(lián)合用藥組15天的瘤體重 ±s／g

表1 PA、CDDP、5－Fu及聯(lián)合用藥組15天的瘤體重 ±s／g

＊＊P＜0.01 ＊P＜0.05

分組nˉx±s 5 2.81±0.53 CDDP組 4 2.46±0.36 5－Fu組 3 2.83±0.42 PA＋CDDP組 5 2.09±0.71＊＊PA＋5－Fu組 4 2.33±0.51＊對(duì)照組PA組5 3.12±0.24

圖6 荷瘤鼠PA組、肺組織無病變 光鏡200×

圖7 5Fu組荷瘤鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚、塌陷、光鏡200×

圖8 對(duì)照組大部分細(xì)胞形態(tài)良好，結(jié)構(gòu)完整 光鏡200×

圖9 PA＋CDDP組腫瘤細(xì)胞可見壞死灶 光鏡200×

表結(jié)果表明，PA 聯(lián)合CDDP及5－Fu后，對(duì)B16荷瘤小鼠抑癌作用與對(duì)照組相比，差異顯著，而單一用藥組與對(duì)照組相比雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但瘤體重量有減輕趨勢(shì)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期分析表明：PA、5－Fu、CDDP、PA＋5－Fu、PA＋CDDP，對(duì) Hep－2細(xì)胞周期均有影響，即將 Hep－2細(xì)胞周期阻滯于G1期［4－7］，G1期細(xì)胞增多，同時(shí)伴S期細(xì)胞減少［8］。使G2／M期細(xì)胞減少，細(xì)胞凋亡率上升。腫瘤細(xì)胞可分為增殖細(xì)胞與非增殖細(xì)胞兩種：增殖細(xì)胞與腫瘤生長(zhǎng)直接有關(guān)，對(duì)抗腫瘤較敏感，是化療重要攻擊目標(biāo)。而PA作用下使這種作用產(chǎn)生了協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)，故PA＋5－Fu或PA＋CDDP化療藥物的療效比較單一5－Fu以及CDDP作用明顯增強(qiáng)。

胡國(guó)華［9］等用嗜銀蛋白檢測(cè)技術(shù)預(yù)測(cè)頭頸腫瘤化療藥物的敏感性，共59例，喉鱗癌38例，喉咽鱗癌2例，鼻咽鱗癌16例，鼻腔惡性淋巴瘤2例，耳廓鱗癌1例，均經(jīng)病理證實(shí)。實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的敏感藥物順序大致與臨床結(jié)果符合，其敏感性較好的藥物如：CDDP、VCR（長(zhǎng)春新堿）與5Fu，PYM（平陽(yáng)霉素）等是目前頭頸腫瘤化療中首選，這與我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，同樣在PA作用下，以CDDP對(duì)PA的作用更為敏感，說明在頭頸腫瘤化療治療應(yīng)以CDDP為基礎(chǔ)。PA增強(qiáng)化療藥CDDP對(duì)喉癌細(xì)胞珠Hep－2凋亡途徑［10］。

5－Fu、CDDP是臨床上常用的化療藥物，具有較強(qiáng)的抑瘤作用，但作為一種免疫抑制劑，臨床應(yīng)用時(shí)毒副作用較大。在荷瘤鼠B16動(dòng)物模型治療研究中，采用了胃腸給藥及健側(cè)皮下給藥方式，可以排除PA及5－Fu、CDDP局部用藥而對(duì)腫瘤所產(chǎn)生的直接毒性作用。從一般狀態(tài)上及病理上觀察，研究結(jié)果表明聯(lián)合給藥組小鼠腫瘤受到抑制，其中以PA＋CDDP組最明顯，瘤體體積縮小明顯，PA聯(lián)合CDDP及5－Fu后，對(duì)B16荷瘤小鼠抑癌作用與對(duì)照組相比，差異顯著。說明荷瘤鼠對(duì)5－Fu、CDDP不耐受，可能與化療毒副作用有關(guān)。分析5－Fu、CDDP兩組，不明顯原因死亡的荷瘤鼠，可能和化療藥物的毒性作用及并發(fā)癥有關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明PA在動(dòng)物體內(nèi)無毒副作用或者毒副作用很低，動(dòng)物對(duì)其有很好的耐受。

腫瘤生物化學(xué)療法（Biochemotherapy）是生物治療和化學(xué)治療聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤的全新綜合治療模式，但是化療一般多為細(xì)胞毒藥物，靶向性不強(qiáng)，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)明顯影響患者造血、免疫和某些器官（系統(tǒng)）的功能，易產(chǎn)生多藥耐藥而失敗?；熀蜕镏委煹穆?lián)合往往可以起到相加或協(xié)同治療的作用。

本實(shí)驗(yàn)說明苯乙酸和5－Fu、CDDP化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可以明顯增強(qiáng)對(duì) Hep－2細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化，顯著提高促凋亡作用。荷瘤鼠動(dòng)物模型治療，PA＋CDDP組與PA＋5－Fu聯(lián)合用藥組腫瘤體積縮小，具有顯著性，瘤體抑癌率較單一用藥組明顯提高，化療藥物的毒副作用于苯乙酸聯(lián)合應(yīng)用后可以減輕，荷瘤鼠治療的實(shí)驗(yàn)為喉癌化療治療提供了新的思路。并且減少化療藥物劑量及減少耐藥性，減輕毒副作用及并發(fā)癥的發(fā)生，為喉癌臨床治療提供了理論基礎(chǔ)。

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