小鼠急性氧化樂果中毒對c－fos在肌組織內(nèi)表達的影響

劉晶瑤，谷麗娜，周春奎＊

（吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院1.二部 神經(jīng)內(nèi)科；2.急救醫(yī)學(xué)科，吉林 長春130031）

骨骼肌即刻早期反應(yīng)基因c－fos作為細(xì)胞早期快速反應(yīng)基因家族的重要成員，在生理狀態(tài)下，正常的生理需要可決定基因的表達，表現(xiàn)為它可控制細(xì)胞生長與分化的信號；在應(yīng)激狀態(tài)下，這些受基因調(diào)控的蛋白能夠提高生物體的耐受性和應(yīng)激能力，并起到重要的作用［1］。在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有機磷農(nóng)藥應(yīng)用十分廣泛，多年以來有關(guān)其中毒機制的研究較多，但關(guān)于在農(nóng)藥作用下c－fos表達的變化研究甚少。本研究采用免疫組化技術(shù)，在整體水平上觀察了農(nóng)藥對這類基因表達的影響。以求進一步在形態(tài)學(xué)上探尋c－fos基因與中間期肌無力綜合征（intermediate myasthenia syndrome，IMS）之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物來源

昆明小鼠93只，雄性，鼠齡：8周，體重：20±3g，健康活潑、皮毛有光澤，均由吉林大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要的實驗試劑和儀器

主要試劑：40%氧化樂果乳油，按1∶200蒸餾水稀釋。硫酸阿托品注射液（每支：5mg·ml－1）。0.9%氯化鈉注射液500ml若干瓶。實驗儀器：物理天平，高速離心機，日立H7600全自動生化檢測儀，1ml無菌注射器若干。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組 空白對照組：昆明小鼠8只，不染毒也不給藥。生理鹽水對照組：共10只。實驗組：按染毒后時間點（24h、48h、72h、96h及5－7d）分籠，15只／籠，按清潔級動物房常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.2 動物給藥 生理鹽水對照組：根據(jù)染毒劑量，應(yīng)用等量生理鹽水腹腔注射給藥。實驗組：每籠同時腹腔注射40%氧化樂果（50mg·kg－1）及阿托品（10mg·kg－1）。根據(jù)染毒后小鼠表現(xiàn)，當(dāng)出現(xiàn)抽搐頻繁、呼吸困難等嚴(yán)重并發(fā)癥情況時，追加阿托品用量以渡過急性期［2］。

1.3.3 肌力測定 按時間點觀察各組小鼠攝食、姿勢和活動情況，其中對染毒后1－7d小鼠進行肌力測定。肌無力評定標(biāo)準(zhǔn)按Lennon等的分級法［1］，如下：0級：沒有肌無力表現(xiàn)；1級：嘶咬無力，四肢力量較差，在光滑地面上前肢打滑，活動減少；2級：明顯無力，休息時脊背呈隆起姿勢，頭尾下垂、前肢趾彎曲，動作不協(xié)調(diào)；3級：嚴(yán)重?zé)o力表現(xiàn)，無嘶咬動作，肌肉震顫，呼吸困難，瀕死或死亡。

1.3.4 小鼠腓腸肌內(nèi)c－fos陽性細(xì)胞率的檢測 取空白對照組小鼠8只、生理鹽水對照組小鼠10只以及實驗組中按染毒后各時間點隨機抽取每籠6只或8只昆明小鼠斷頭處死，取腓腸肌組織，10%甲醛固定并行石蠟切片，采用S－P免疫組化染色方法進行免疫組化染色。切片觀察及結(jié)果判定c－fos陽性表達為細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色顆粒.陰性細(xì)胞為藍染。

1.4 圖像分析 在光學(xué)顯微鏡（OLYMPUSBX51）下對每張玻片在400倍視野下任取5張，應(yīng)用圖像分析軟件測量每張圖片計數(shù)視野陽性細(xì)胞率（陽性細(xì)胞／視野內(nèi)整個細(xì)胞數(shù)）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。1－7 d各時間點小鼠出現(xiàn)肌無力百分率的比較采用χ2檢驗。各組c－fos陽性細(xì)胞率用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組c－fos陽性細(xì)胞率組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 染毒后小鼠肌力變化

染毒后1－7d各時間點小鼠出現(xiàn)肌無力百分率最高在24h，主要集中在染毒后1－3d；5－7d出現(xiàn)肌無力發(fā)生率較低。通過χ2檢驗，染毒后1－4d出現(xiàn)肌無力百分率與5－7d比較差異有顯著性（P＜0.05）（表1）。

2.2 染毒后小鼠肌肉組織c－fos表達的變化

染毒后1－4d發(fā)生肌無力小鼠腓腸肌細(xì)胞c－fos表達均有不同程度升高，與空白對照組、生理鹽水對照組及正常肌力小鼠比較差異有顯著性（P＜0.01）。正常肌力小鼠腓腸肌細(xì)胞c－fos陽性細(xì)胞率與空白對照組、生理鹽水對照組比較差異無顯著性。

表1 1－7d各時間點小鼠出現(xiàn)肌無力的百分率

表2 1－4d各時間點小鼠c－fos陽性細(xì)胞率變化（±s）

表2 1－4d各時間點小鼠c－fos陽性細(xì)胞率變化（±s）

注：與空白對照組及生理鹽水對照組比較＊P＜0.01，與正常肌力組比較△P＜0.01

時間 n c－fos（%）空白對照組28 8.04＋3.13 8 7.25＋2.03生理鹽水對照組 10 6.58＋2.11肌無力組 25 22.25＋7.65＊△正常肌力組

3 討論

乙酰膽堿為中樞神經(jīng)系統(tǒng)某些部位及膽堿能神經(jīng)的化學(xué)傳導(dǎo)介質(zhì)。有機磷殺蟲藥的毒性作用在于能與膽堿酯酶結(jié)合成為磷?；憠A酯酶，后者性質(zhì)穩(wěn)定，失去分解乙酰膽堿的能力，造成乙酰膽堿在效應(yīng)器的堆積，從而出現(xiàn)臨床中毒癥狀。在有機磷農(nóng)藥中毒時，通過對膽堿酯酶活力的測定，對中毒程度判定有一定的參考價值。在前期研究階段我們已對急性有機磷農(nóng)藥中毒小鼠進行了酶學(xué)動態(tài)觀察［2］，在染毒后1－7d內(nèi)，膽堿酯酶活力呈持續(xù)抑制狀態(tài)，即無論是肌無力小鼠，還是非肌無力小鼠，其膽堿酯酶均受到明顯抑制，并得出結(jié)論膽堿酯酶活力持續(xù)低下可能是IMS發(fā)生的啟動因素，但不是IMS發(fā)生的直接原因。

c－fos基因是即刻早期基因的一種，fos蛋白為其表達產(chǎn)物。正常情況下。c－fos基因的表達是極低的，它的主要作用是參與細(xì)胞主要的生理功能，如生長、分化、信息傳遞、學(xué)習(xí)和記憶等生理功能。同時它還可調(diào)節(jié)神經(jīng)生長因子、前腦啡肽、酪氨酸烴化酶、血管活性腸肽等其它后期反應(yīng)基因的長期表達［3］，促使神經(jīng)細(xì)胞的適應(yīng)性變化，并能增強細(xì)胞的修復(fù)能力。同時在某些因素的刺激下，c－fos基因能被誘導(dǎo)快速表達.在細(xì)胞周期早期和生長相關(guān)步驟起作用。國外學(xué)者的實驗結(jié)果表明，c－fos表達的增強與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。c－fos基因的特征為靜止的細(xì)胞，當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變時，如受到外界如缺血、缺氧、癲癇、外傷和外周神經(jīng)刺激等情況，在特定的腦區(qū)內(nèi)能迅速表達［4］，同時各部位表達強弱也不同，但這種表達是短暫的，解除相應(yīng)刺激后，其表達也很快消失。但當(dāng)c－fos基因表達異常增加，還可干擾細(xì)胞增殖和凋亡的動態(tài)平衡，繼而誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤形成［5］。有研究表明。c－fos基因表達與腦缺血后神經(jīng)元的死亡或凋亡呈平行關(guān)系，其表達程度反映了腦缺血后神經(jīng)元死亡或凋亡的程度。c－fos基因表達越高，相應(yīng)的腦組織損傷越嚴(yán)重［6］。何鳳生等人［1］早在1999年針對急性有機磷中毒后肌無力的發(fā)生與c－fos基因表達進行了初步探討，結(jié)果表明，有機磷農(nóng)藥的刺激可以快速誘導(dǎo)c－fos的表達。本研究主要針對急性有機磷中毒患者全部膽堿能危象消失后1－4天所發(fā)生的IMS是否與c－fos基因表達變化有關(guān)。結(jié)果表明，有機磷中毒1－4天組肌無力小鼠腓腸肌組織c－fos陽性細(xì)胞率明顯高于對照組及正常肌力小鼠，而有機磷中毒后1－4天是IMS主要發(fā)病時期，因此這提示我們c－fos表達增高不光與急性期有機磷農(nóng)藥中毒快速誘導(dǎo)有關(guān)，而且還與急性期過后IMS的發(fā)生存在一定關(guān)系，更詳細(xì)的發(fā)病機制有待于進一步的功能性基因研究。

［1］楊東仁，牛 勇，何鳳生.c－fos基因在樂果中毒后肌無力大鼠肌組織中的表達［J］.衛(wèi)生研究，1999，17（6）：373.

［2］劉晶瑤，周春奎，江新梅.小鼠急性氧化樂果中毒致肌無力的生化指標(biāo)變化及意義［J］.臨床神經(jīng)病學(xué)，2009，22（5）：356.

［3］Buytaert KA，Kline AE，Montanez S，et al.The temporal pattern of c－fos and basic fibroblast grouth factor expression following a unilateral anteromedial cortex lesion［J］.Brain Res，2001，894：121.

［4］程景麗，和姬苓.腦缺血再灌注后c－fos基因表達與神經(jīng)細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究進展［J］.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2009，41（1）：65.

［5］David JP，Mehic D，Bakiri L，et al.Essential role of RSK2in c－fos dependent osteosarcoma development［J］.J Clin Invest，2005，115：664.

［6］Whitifield J，Neame SJ，Paquet L，et al.Dominant－negative c－Jun promotes neuronal survival by reducing BIM expression and inhibiting mitochondrial cytochrcmec release［J］.Neuron，2001，29（3）：629.